Kidney Int ：肾小管生物钟调节功能障碍导致糖尿病患者肾糖异生增强和加重高血糖

背景及目的：在糖尿病患者中，肾脏通过增加原尿中葡萄糖的重吸收和上调近端小管中的糖异生来促进糖尿病高血糖的发生。然而，血糖水平的慢性升高可能反过来导致糖尿病肾病(DN)，这是糖尿病最严重的并发症之一，其特征是肾小球、肾小管和肾脏血管受损。虽然代谢应激是糖尿病肾病发生和发展的主要因素，但在大多数糖尿病患者中，高血糖本身并不会导致肾功能不全。这表明，合并症或环境、遗传或表观遗传的变化可能是启动和/或加速进展DN所必需的。生物钟是一种普遍存在的分子计时机制，它将细胞、组织和系统的生物功能与24小时的环境周期同步。局部生物钟驱动细胞类型和组织特有的节律，它们的失调与一系列疾病的发病和/或进展有关。然而，糖尿病患者肾脏中内在生物钟的病理生理作用仍不清楚。

方法：为了解决这个问题，我们用链脲佐菌素诱导了足细胞(cKOp小鼠)或肾小管(cKOt小鼠)中缺乏昼夜节律转录调节因子BMAL1的小鼠患I型糖尿病。

小鼠模型制备：8周龄Bmal1lox/lox/Nphs2-RTTA/LC1小鼠(cKOp小鼠)或8周龄Bmal1lox/lox/Pax8-RTTA/LC1小鼠(cKOt小鼠)经DOX(饮水中2 mg/ml)处理2周后，Bmal1(ARNTL)基因失活。他们的对照组(Bmal1lox/lox小鼠)接受相同的DOX治疗。在DOX治疗结束一周后，通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ，50 mg/kg体重，每日5天)诱导I型糖尿病。溶媒处理的小鼠接受PBS的溶媒注射。所有实验均在最后一次注射STZ或溶媒8周后进行。在所有实验中，从ZT9处死的小鼠身上采集组织和血液(ZT-Zeitgeber时间单位；ZT0是开灯时间，ZT12是关灯时间)。

代谢笼：小鼠被饲养在个体代谢笼子中(Tecniplast，意大利)。在4天的适应期后进行24小时的尿液收集。

血浆和尿液生化测定：用Vaudois中心医院临床实验室(LCC)测定尿和血浆Na+、K+、Ca2+、Mg2+、磷酸盐、肌酐、葡萄糖、尿酸和尿素浓度及渗透压。用酸碱仪(Metrohm)测定尿液pH值。使用EPOC血液分析仪(西门子医疗)测量动-静脉混合血的血液pH值和血气。尿铵测定采用Berthelot法。尿可滴定酸测定采用Chan25方法。采用放射免疫法(DPC)测定血浆醛固酮水平。用Mercodia公司的试剂盒测定血浆胰岛素。

葡萄糖耐量试验(GTT)：禁食15小时后，给空白对照组和cKOt小鼠腹腔注射葡萄糖(1g/kg体重)。分别于注射葡萄糖前(t=0)、注射葡萄糖后15、30、60、90、120、180min，用血糖读数仪测定血糖。

胰岛素耐量试验(ITT)：禁食4h后，给对照组和cKOt小鼠腹腔注射0.5U/kg体重的重组人胰岛素(人重组胰岛素，Sigma)。分别于胰岛素注射前(t=0)、胰岛素注射后15、30、45、60、90、120、150、180min测定血糖。如果血糖降至2 mm以下，则通过腹腔注射30毫克葡萄糖拯救小鼠，并将其排除在分析之外。

RNA测序技术：RNA-SEQ按照Ansermet等人在6.Mus Musculus中的描述进行。使用GRCm38.92基因注释。使用TMM归一化对基因计数进行定标，并使用LIMMA R包27中的“CPM”函数将其对数转换为每百万计数(CPM)。计算了KO和Ctrl动物在未处理(PBS)和处理(STZ)条件下的差异表达以及两者之间的相互作用。对于这三种比较中的每一种，选择FDR<5%的基因，用‘clusterProfiler’28进行GO‘Biological Process’富集分析。Q值<0.01的术语被认为是重要的，并使用带有默认参数的函数‘SIMPLIZE’进行进一步处理，以消除冗余。

结果：在患有糖尿病的cKOp和cKOt小鼠中，生物钟功能障碍与糖尿病肾病的发生没有相关性。然而，与链脲佐菌素治疗的对照组相比，患有糖尿病的cKOt小鼠表现出加高血糖加重，尿中葡萄糖排泄增加，多尿增加，肾脏肥大更明显。mRNA和蛋白质表达分析显示，与糖尿病对照组小鼠相比，cKOt糖尿病小鼠肾脏中的糖异生途径显著增强。CKOt糖尿病小鼠的转录分析和功能分析确定了直接或间接影响糖异生途径的多种机制的变化。

图1 溶媒或链脲佐菌素处理的对照组和cKOp小鼠的一般特征。A.非空腹血糖；B.体重(BW)；C.GFR(菊粉清除率)；D.尿糖；E.尿量；F.考马斯亮蓝尿蛋白染色。LMWP-低分子量蛋白质；ALB=白蛋白(65 KDa)。对于所有的小鼠，24小时尿的0.3%(体积)被加载到SDSPAGE凝胶上。除GFR测定(STZ对照组和cKOp组分别为n=6和n=9)外，其余各组均为±SEM(n=9)。所有结果均取自19周龄的动物。Sidak多重比较检验的双因素方差分析。*P<0.001，†P<0.01，‡P<0.001。

图2 溶媒或链脲佐菌素处理的对照组和cKOt小鼠的一般特征。体重，溶媒对照组和cKOt小鼠n=8，STZ对照组和cKOt小鼠n=9。C.空腹血糖(禁食16小时)，对照组和cKOt小鼠，n=9，STZ对照组和cKOt小鼠，分别n=7和n=6；d.溶媒或STZ治疗对照组和cKOt鼠的胰岛素水平；n=9和n=6，用于溶媒治疗的对照组和cKOt小鼠；c.空腹血糖(禁食16小时)，分别为STZ治疗的对照组和cKOt小鼠，n=7和n=6；d.空腹血糖(禁食16小时)，分别为对照组和cKOt小鼠，n=7和n=6；d.空腹血糖(禁食16小时)，分别为对照组和cKOt小鼠，n=7和n=6。在ZT18测定静止期中期的血浆胰岛素水平。E.在GTT过程中，使用溶媒或STZ治疗的对照组和cKOt小鼠的血糖水平被测量。溶媒对照组和cKOt小鼠n=9，STZ对照组和cKOt小鼠分别n=7和n=6。F.在ITT过程中，使用溶媒或STZ治疗的对照组和cKOt小鼠的血糖水平被测量。溶媒或STZ处理的对照组小鼠n=5，溶媒或STZ处理的CKO小鼠n=6。糖尿病大鼠肾脏肥大，每组9只。用肾脏重量(KW)除以体重(BW)来评估肾脏肥大。计算注射STZ的对照组和CKOt动物的相对KW/BW值，将100%归因于相应的载体注射组。GFR(菊粉清除率)，STZ对照组和cKOt小鼠分别为5只和6只，均值±SEM，双因素方差分析，采用Sidak多重比较检验。*p<0.001，†p<0.01，‡p<0.001

图3 溶媒或链脲佐菌素处理的对照组和cKOt小鼠的水摄入量和尿液特征。B.24小时尿量溶媒处理对照组或cKOt小鼠n=8，STZ处理对照组或cKOt小鼠n=9；c.尿液渗透压，溶媒处理对照组或cKOt小鼠n=8，溶媒处理对照组或cKOt小鼠n=9；d.部分提取液，c.尿渗透压，溶媒处理对照组或cKOt小鼠n=8，溶媒处理对照组或cKOt小鼠n=7，STZ处理对照或cKOt小鼠n=9；d.部分提取液，c.尿渗透压，溶媒对照组或cKOt小鼠n=8，溶媒处理对照组或cKOt小鼠n=9。F.磷酸盐排泄分数，溶媒对照组小鼠，n=8，溶媒对照组小鼠，n=7，STZ治疗对照组小鼠，n=9；g，镁的排泄分数，n=8，n=7，(n=8，n=9，n=9)。均值±SEM，双因素方差分析，Sidak多重比较检验。*P<0.001，†P<0.01，‡P<0.001。

图4 GO生物法富集分析。A.对溶媒处理的对照组和cKOt小鼠肾脏差异表达的转录产物进行GO分析。B.GO分析STZ处理的对照组和cKOt小鼠肾脏中差异表达的转录本。C.对表现出基因型与治疗交互作用的转录本进行GO分析。最有意义的前20个术语的圆点图(Q值<0.01)。多余的词汇被过滤掉了。Generatio表示用显示的术语注释的重要基因的部分。点的大小代表用显示的术语注释的重要基因的数量。每种情况下n=6。D.编码酶的转录本和参与肾脏糖异生的转录本的折叠图。表达水平值取自补充表2、3、4和5。*p<0.001，†p<0.01，‡p<0.001。GLS-谷氨酰胺酶；GLUL-谷氨酰胺合成酶；GLUD1-谷氨酸脱氢酶；PC-丙酮酸羧化酶；PCK1-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；FBP1/2-果糖-1，6-二磷酸酶；G6PC-葡萄糖-6-磷酸酶；GLUT2-葡萄糖转运蛋白2；SNAT3-谷氨酰胺转运蛋白；NHE3-钠氢交换器3。STZ处理的对照组和cKOt小鼠之间差异表达的红-p值。在BLUE-P值中显示溶媒处理的对照组和cKOt小鼠之间的差异表达。红色和蓝色箭头表示CKOt小鼠↑表达增加或↓表达减少。F.对PBS或STZ处理的对照组和cKOt小鼠(n=6)肾脏中GLUD1和PCK1的毛细管Western印迹进行定量分析(分别为补充图2和3)。A.u-任意单位。Sidak多重比较检验的双因素方差分析。*P<0.001，†P<0.01，‡P<0.001。

图5 A.编码转录因子、共激活因子和共抑制因子的转录本的折叠图，这些转录因子在载体和STZ处理的对照组和cKOt小鼠中控制糖异生酶的转录。表达水平值取自补充表2、3、4和5。*p<0.001，†p<0.01，‡p<0.001。B.图5A所示数据的示意图。STZ处理的对照组和cKOt小鼠之间差异表达的red-p值。在BLUE-P值中显示溶媒处理的对照组和cKOt小鼠之间的差异表达。红色和蓝色箭头表示CKOt小鼠↑表达增加或↓表达减少。

图6 对照组和cKOt小鼠的血浆pH、血浆碳酸氢盐、血浆碱过量、尿液pH、24小时尿可滴定酸度(TA)和铵排泄量。N=6-9。Sidak多重比较检验的双因素方差分析。*P<0.001，†P<0.01，‡P<0.001。

结论：我们证明了内在肾小管生物钟功能障碍可通过增强肾近端小管的糖异生而加重糖尿病高血糖，进一步强调了生物钟调节在糖尿病患者中的重要性。

原文出处：

Ansermet C,  Centeno G,  Bignon Y,et al.Dysfunction of the circadian clock in the kidney tubule leads to enhanced kidney gluconeogenesis and exacerbated hyperglycemia in diabetes.Kidney Int 2021 Nov 24