计算机辅助中医药研究——以三拗汤治哮喘机制探讨为例

三拗汤源于《太平惠民和剂局方》，其中麻黄不去根节，杏仁不去皮尖，甘草不炙而生用，以达到宣肺、平喘、止咳的作用，临床主要用于缓解哮喘等呼吸道疾病，但其作用机制仍有待探究。

近日，《Computers in Biology and Medicine》杂志发表了一篇名为“Computer-aided investigation of Traditional Chinese Medicine mechanisms: A case study of San-Ao decoction in asthma treatment”的文章，运用计算机辅助研究深入挖掘了三拗汤的作用机制。

三拗汤化学成分探究

研究者首先使用UPLC-Q-TOF/MS技术对三拗汤的化学成分进行了分析，根据质荷比（m/z）、保留时间（Tr）、相对分子质量（Mw）等参数，通过文献和数据库的匹配，获得28个信号峰，其中2个来自于杏仁，9个来自麻黄，17个来自甘草。

图1 三拗汤的主要化学成分表征

TRPV1通道蛋白结合位点预测

瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）是瞬时受体感受器电位通道的成员之一，主要分布在感觉神经的末梢，被激活后可释放多种神经递质，进而引发一系列生物学作用。

有研究表明，TRPV1通道在哮喘等呼吸道疾病中发挥着重要的作用。基于此，研究者对TRPV1蛋白的结构进行了解析：TRPV1蛋白由839个氨基酸组成，整体包括N端环区、锚定蛋白重复结构域、螺旋区和C-末端环区。据既往文献可知，Ca²⁺的结合位点位于跨膜螺旋区，ATP的结合位点多位于锚定蛋白重复结构域。

图2 TRPV1蛋白结构

随后，研究者参考N端锚定蛋白重复结构域（PDB：6L93）和跨膜螺旋结构域（PDB：7LQZ）的晶体结构，使用Schrodinger软件对TRPV1潜在的结合位点进行了预测，这些预测位点恰恰是“研究的切入点”。

 图3 TRPV1结合位点预测

三拗汤化学成分与TRPV1蛋白的分子对接

接下来，研究者采用Glide模块对14个TRPV1蛋白的预测位点与28种三拗汤的主要化学成分进行了分子对接，共获得392个对接结果。

 图4 三拗汤的主要化学成分与TRPV1蛋白的分子对接

研究者又挑选三拗汤中的代表性有效成分麻黄碱、苦杏仁苷和依诺酮，分别与TRPV1通道蛋白的结合进行了模拟，结果发现麻黄碱可能与TRPV1的碱性氨基酸（如D647、E211和D509）结合，而苦杏仁苷的结合位点仅是D509。

 图5 麻黄碱、苦杏仁苷和依诺酮与TRPV1的分子对接

实验验证：三拗汤主要成分对TRPV1通道钙离子内流的影响

基于以上结合位点的发现，研究者又分别构建了TRPV1的D647、E211和D509位点的同义突变表达载体，并转染至16HBE细胞，获得稳定的细胞株。紧接着，研究者以10ng/ml的IL-4作为对照组，检测了TRPV1通道中的钙离子内流情况，结果发现，突变E211位点钙离子内流显著增加，而突变D647位点和D509位点的钙离子内流则恰恰相反，竟呈现明显的下降趋势。而经麻黄碱、苦杏仁苷和依诺酮处理后，突变E211位点的TRPV1通道钙离子内流显著下调，突变D647位点和D509位点的TRPV1通道钙离子内流无明显变化。

这提示D647位点和D509位点可能与TRPV1通道的钙离子内流密切相关，由此可知，麻黄碱、苦杏仁苷和依诺酮产生效应的机制极可能是与这两位点的相互作用有关。

图6 钙离子内流情况

具体来看，D647位点是Ca²⁺的结合位点，与之竞争性结合可抑制钙离子内流，进而得出“影响TRPV1通道的钙离子内流不足为奇”，但D509位点与小分子结合影响钙离子内流的的确确是首次发现。

为了进一步搞清楚D509位点是如何影响钙离子内流的，研究者采用分子动力学模拟技术进行观察，结果发现，当麻黄碱或苦杏仁苷等小分子与D509位点结合时，D509和R500/R409之间的相互作用网络被破坏，进而导致TRPV1的构象发生改变。

图7 分子动力学模拟

为了避免混杂因素干扰，研究者扩大试验成分范围，扩展至“麻黄碱、苦杏仁苷、依诺酮成分以及三者的配伍”对TRPV1通道的钙离子内流影响探讨，研究发现，单个麻黄碱或苦杏仁苷处理后均能显著降低钙离子内流，但论降钙离子内流效果最佳，当属“麻黄碱与苦杏仁苷联合应用”。

图8 三拗汤对16HBE细胞TRPV1通道钙离子内流的影响

综上，三拗汤的主要化学成分可以与TRPV1的D509、D647位点结合，发挥抑制钙离子内流作用，从而改善哮喘等呼吸系统疾病。

参考文献：

Jiang M, Yan L, Li M, et al. Computer-aided investigation of Traditional Chinese Medicine mechanisms: A case study of San-Ao decoction in asthma treatment. Comput Biol Med. Published online December 30, 2023. doi:10.1016/j.compbiomed.2023.107868