​武汉轻工乔洁/湖北大学刘奕课题组《自然·通讯》：Cas12a联合分裂crRNA体系实现RNA无扩增快速检测

近期，CRISPR/Cas12a等新型核酸检测技术在病毒鉴定、疾病诊断辅助及预后评估等方面取得了显著进展 [1-3]。Cas12a具有一种特殊能力，即在识别并切割DNA后，能够非特异性地切割周围的任何单链DNA分子。与直接检测DNA不同，RNA底物需先逆转录成DNA才能被Cas12a识别。此外，基于Cas13的miRNA检测方法通常具有高于10 pM的检测限 [4]。相较于Cas12a使用的单链DNA探针，Cas13a的RNA探针成本更高，且更易降解，增加了假阳性风险和检测成本。因此，开发新的基于Cas12的诊断工具以解决这些问题变得尤为迫切。

近日，湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室刘奕课题组，和武汉轻工大学生命科学与技术学院乔洁课题组在《Nature Communications》发表了题为: Split crRNA with CRISPR-Cas12a enabling highly sensitive and multiplexed detection of RNA and DNA的研究论文。该研究发现了Cas12a的crRNA可被分解为茎环RNA和配对RNA两个模块，随后与Cas12a蛋白重新组装形成具有生物活性的核酸蛋白复合物。基于此，本研究提出了一种创新的 “分裂-重组” Cas12a系统，并利用该系统开发了无需逆转录和核酸扩增的RNA即时检测技术SCas12a assay [5]。

通过添加过量的ssDNA激活剂，SCas12a能够直接检测临床样本中的miRNA，其荧光读数法的检测限可达到100 fM。更有趣的是，SCas12a还兼容侧向流试纸条（LFA），将检测限进一步降低至10 fM。此外，SCas12a检测法适用于识别无复杂结构的长链RNA，能精确区分miRNA和其前体pre-miRNA，并具有检测DNA/RNA混合靶标的多重核酸检测能力。通过与临床医生的紧密合作，该技术有望应用于疾病生物标志物的检测和肿瘤手术安全切缘的界定，为生命科学和临床医学研究提供新的研究工具。

综上所述，该研究开发了一种新型SCas12a核酸检测方法，相较于传统的Cas12a检测技术如DETECTR，具有以下优势：（1）使用成本更低、更稳定的20 nt间隔RNA代替40 nt crRNA；（2）首次实现对成熟miRNA而非pre-miRNA的准确鉴定；（3）能够同时检测miRNA和ctDNA等多种癌症生物标志物；（4）对点突变的特异性优于DETECTR。此外，这一策略的简便性使其有望扩展至其他CRISPR/Cas酶，以开发新的分子诊断方法。

武汉轻工大学乔洁副教授和湖北大学生命科学学院刘奕教授为共同通讯作者，湖北大学生命科学学院硕士研究生陈一川、王馨萍和张骏麒为共同一作。

参考文献

1.Chen, J. S. et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science 360, 436-439 (2018).

2.Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017).

3.Gootenberg, J. S. et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science 360, 439-444 (2018).

4.Huyke, D. A. et al. Enzyme Kinetics and Detector Sensitivity Determine Limits of Detection of Amplification-Free CRISPR-Cas12 and CRISPR-Cas13 Diagnostics. Anal. Chem. 94, 9826-9834 (2022).

5.Chen, Y. C. et al. Split crRNA with CRISPR-Cas12a enabling highly sensitive and multiplexed detection of RNA and DNA. Nat. Commun. 15, 8342-8354 (2024).

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-52691-x