揭示ALS/FTD病人染色体结构异常新机制

超过50种遗传性疾病与核苷酸重复序列的突变有关，如脆性X综合症，弗里德西共济失调，遗传性肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）以及额颞叶痴呆(Frontotemporal dementia，FTD) 等【1】。ALS是最常见的运动神经元退行性疾病，部分病人伴有FTD。位于C9orf72非编码区内GGGGCC异常扩增最常见的ALS/FTD遗传突变。此外，该突变还与其它神经退行性疾病相关，如亨廷顿病、阿尔兹海默症等。目前有两大假说阐述该突变的致病机制【2】。1. Gain-of-Toxicity：即 (GGGGCC) n通过转录、翻译产生具有毒性 (GGGGCC) n RNA和Dipeptide Repeats；2. Loss-of-Function：由于 (GGGGCC) n突变位于C9orf72最主要转录本转录起始之前，因此可能导致了病人中C9orf72表达量的显著减少。然而，GGGGCC异常扩增导致神经元退行性变的分子机制仍然不清楚。

研究ALS/FTD的分子病理机制，对多种遗传型ALS/FTD做了大量深入研究。2023年2月22日，该研究团队在Neuron杂志发表题为DNA-initiated epigenetic cascades driven by C9orf72 hexanucleotide repeat 的研究论文。与 (GGGGCC) n RNA毒性和DPR蛋白毒性不同，这项研究证实了 (GGGGCC) n DNA毒性，并且该毒性是导致C9orf72 ALS/FTD病人C9orf72表达缺失的重要原因。

深入阐述了C9orf72蛋白在调控细胞脂代谢的作用，并进一步证明该调控作用的紊可能导致了C9orf72 ALS/FTD神经退行性变【3】。在本研究中，刘杨和其同事将SILAC标记的细胞核蛋白与生物素标记的(GGGGCC)6DNA双链共同孵育，通过蛋白质普鉴出DAXX是 (GGGGCC)n强相互作用蛋白。在携带(GGGGCC)1100和(GGGGCC)2600的病人细胞中，DNA原位杂交结合免疫荧光染色进一步证实了DAXX蛋白与(GGGGCC)n DNA的共定位。随后，在病人源的B淋巴细胞、iPSCs分化的运动神经元和病人脊髓神经元内发现，DAXX蛋白显著升高，并在细胞核内形成大量的蛋白凝聚体。

通过一系列体内外实验证实，DAXX蛋白具有液液相变功能。更重要的事，(GGGGCC)n双链DNA与DAXX相互结合能促进DAXX形成更多的液滴状凝聚体，并且与(GGGGCC)n序列长度成正比关系。为进一步研究DAXX相变在细胞内的生物功能作用，刘杨和其同事对DAXX进行了光遗传学改造，使得改造后DAXX的蛋白相变受光照调控。结合ATAC-PALM和HiChIP技术，他们发现DAXX在细胞内的蛋白相变会导致染色体三维结构发生改变，从而导致转录抑制作用。以C9orf72基因为列，DAXX长时间形成液滴导致C9orf72转录水平显著降低；同时引起C9o rf72基因附近subTAD边界改变，形成新的subTAD。

外界应激会上调细胞C9orf72的转录表达。有意思的事，这种现象却在携带(GGGGCC)n突变的运动神经元内消失了。通过ATAC-seq和ChIP实验发现，(GGGGCC)n的异常扩增导致C9orf72启动子区的染色体结构和表观遗传修饰异常。进一步研究证实，敲降DAXX，能过纠正(GGGGCC)n扩增突变导致的染色体异常，从而上调正常条件下和应激条件下的 C9orf72转录表达。更重要的是，通过基因方式抑制DAXX表达，药物纠正表观遗传紊乱，或过表达C9orf72能过提高(GGGGCC)n突变神经元对外界应激的耐受性。

综上，该研究首次从DNA毒性阐述了 (GGGGCC)n新的gain-of-toxicity：与细胞核内DAXX相互作用，导致细胞核内DAXX蛋白凝聚体增多，从而引起染色体结构异常和基因表达失调。并且该毒性作用介导了正常环境下和应激条件下的病人细胞中C9orf72的表达缺失。同时，DAXX及其相关的下游表观遗传调控可能成为( GGGGCC)n突变相关疾病的治疗靶点。