一双“慧眼”看穿冻卵活性，拉曼光谱的确“靠谱”

在卵细胞冷冻保存过程中，除了与水冻结和冷冻保护剂毒性相关的损伤外，还会发生与细胞结构材料特性的低温变化相关的损伤。细胞的脂质结构，如膜和脂滴易受到低温损伤。在生理温度下，大多数生物相关脂质处于液态无序相状态。当冷却至低温时，脂质转变为固体状有序相。相变改变了脂质结构的材料特性，包括刚性和扩散速率。因此，这种转变可能会影响不同细胞器中与脂质相关的生物过程。

当拉曼光谱遇上冻融细胞脂滴：原位无标记捕捉脂质相变

细胞膜由具有不同熔点的磷脂混合物组成。细胞膜的现代模型是基于具有不同脂质组成的脂质结构的假设，有序相态的高熔点脂质结构被形象的称之为“筏”。不同相态的脂质共存平衡在细胞功能调节中起重要作用。温度降低会改变不同脂质相间的平衡，从而破坏膜功能。膜特性的变化可能是由于温度变化，除此之外也可能是由于水溶质效应和形成冰晶的影响，因此膜中的脂质相变（Lipid phase transition，LPT）会影响冷冻保存后的细胞活性。

脂滴（Lipid droplets，LDs）是富含脂质的细胞器，在脂质代谢、细胞信号传导和调节中发挥重要作用。LDs的低温变化会影响哺乳动物卵母细胞冷冻保存后的活性。一项实验证明猪胚胎细胞中LDs在耐低温特性研究中的作用明显，即预先进行机械脱水的细胞冷冻保存后在体外继续发育的存活率从0%提高到50%以上。与磷脂膜类似，LD在细胞冷冻过程中会发生LPT。通过与细胞膜进行类比，可以假设细胞质内LDs不是在特定温度的单一熔点下发生LPT，而是向不同熔点的脂质逐渐扩散转变。细胞内LD中的LPT可能会干扰细胞功能，但与LD相关的低温损伤的特定机制仍不清楚，至少到目前为止，尚无明确关于细胞膜和LD在冷冻细胞中脂质空间分离的直接证据。

红外光谱技术是研究生物细胞中脂质相态的最常用的实验方法，拉曼光谱则是另一种探测脂质相态的方法。与红外光谱相比，拉曼散射光谱可在微观尺度上研究冷冻样品，并以非接触、无标记方式进行测量。此外，拉曼技术可抗水分子物质峰的干扰。此前对卵母细胞以及胚胎中单个LD的拉曼研究表明，与甘油三酯和磷脂系统模型相比，拉曼光谱有相对较高的精度检测LPT的开始与扩散。通过相干反斯托克斯拉曼散射研究揭示白色脂肪细胞中大LD在富含脂肪酸的培养基中培养时会发生脂质相态间的分离，这种现象间接表明不同脂质在不同的温度下会发生LPT。

Cryobiology：拉曼光谱技术用于研究细胞冻融后活性是可行的

2020年8月，俄罗斯科学院自动化和电学研究所团队在Cryobiology发表题为“Raman spectroscopy evidence of lipid separation in domestic cat oocytes during freezing”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明在−25°C环境下，脂质在脂滴内会以两种分离的相态共存，且在检测空间区域几微米中具有特定的空间分布，其中的高熔点脂质会分布在脂滴表面附近，而低熔/易熔的脂质分布于内部深处。拉曼光谱技术可揭示细胞中脂质相变不均匀性，证实拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面具有可行性。

图1 研究成果（图源：[1]）

此研究以卵母细胞作为研究对象，使用甘油/丙二醇（Propylene glycol，PG）作为冷冻保护剂，依据标准冷冻方案对卵母细胞进行冷冻保存。具体地，该冷冻方案步骤包含四个阶段：（i）以1℃/min的冷却速率从室温冷却至-7℃；（ii）用冷铜线碰触样品以形成冰核；（iii）在-7℃下保持10分钟；（iv）以0.3℃/min的速度进一步冷却至-25℃。在大多数卵母细胞和胚胎的冷冻程序中在-7℃下保持10分钟以形成冰核，冰核形成是冰结晶所必需阶段，冷却程序在特定温度下暂停以进行拉曼检测。

拉曼采集平台采用固体激光器（激光波长为532.1 nm），100×物镜（NA=0.75），横向分辨率~0.6 µm，纵向分辨率~10 µm，光谱分辨率为2.5 cm-1；以扫描模式测量了一组拉曼光谱，并在指定坐标处探测了拉曼散射；光谱检测范围为1000至3200 cm-1，曝光时间3s；在单个拉曼成像实验中测量约2500条光谱。初步数据处理包括测量光谱中高能离子宇宙线去除、基线校正等。进一步的多变量分析包括用于奇异值分解，以及使用交替最小二乘算法对拉曼光谱进行非负矩阵分解等数据处理方法。

研究结果发现：

1、不同温度下脂滴的拉曼光谱特征具有一定规律性

如图2所示，在不同的冷冻温度下收集卵母细胞的拉曼光谱，并分析对脂质相变敏感的aCH2键在拉曼频移2882 cm-1处的特征表达，其峰值用来表达不同温度下的脂质相态；通过在~2850 cm-1处具有强烈拉伸对称CH2 (sCH2)峰，可以在拉曼图中识别出富含脂质的物质。经过统计，在不同温度下脂滴的光谱特征具有一定规律，不同温度时光谱峰值均数：n=1666@-25℃；n＝1214@-15℃；n＝636@-3℃；n=478@+5℃；n=638@+15℃；在-3℃及以下测量的拉曼光谱（图2b）表明拉伸反对称CH2 (aCH2)峰对LPT敏感。以上统计的数据表明，LPT开始发生的温度是在+5和-3℃之间。

图2 卵母细胞在不同温度下拉曼光谱的平均光谱（图源：[1]）

注：（a）不同温度下（-25℃~+15℃），卵母细胞中脂滴对应的平均拉曼光谱；CH谱带的拉曼特征区域；（b）表示键在2882处的特征峰。虚线是统计基线。

低温下卵母细胞以及胚胎中，aCH2峰的强度大约是sCH2峰强度的0.7倍。该峰的强度低可能有两种不同的情况导致，第一种可能的情况是所有脂质分子都处于大致相同的构相状态，随着温度的降低逐渐变为更有序的构相状态，这种情况对应于均匀的扩散相变；第二种情况涉及脂质分子以有序和无序的相态共存，在这种情况下，处于无序相态的脂质比例会随着温度升高而降低。

2、拉曼光谱用于检测冷冻卵细胞中脂质相分布不均匀性 

为了证实LD中是否存在脂质相态共存，研究人员使用PG作为冷冻保护剂，在T=-25℃条件下处理10分钟后进行两个拉曼成像实验：第一个实验是在-25℃下初步暴露两小时后使用甘油作为冷冻保护剂进行的；第二个实验用于揭示在其他条件下是否会观察到相态共存效应。

研究人员使用NMF-ALS方法构建拉曼谱图，在三个光谱分量的线性组合上分解所有拉曼光谱：这些光谱分量对应于有序相态脂质（SOL）、无序相态脂质（SDL）和细胞质（SC）的贡献。对应的SOL在2882 сm-1处有一个CH2峰，sCH模式下的拉曼位移置为2845 cm-1；SDL无aCH2的显著峰，2849 сm-1处有CH2峰；SC为冷冻保护剂（甘油或PG，取决于实验条件）和细胞质蛋白的水性混合物。

图3显示了在-25℃甘油溶液中冷冻的卵母细胞内部有序（IOL）和无序（IDL）相状态的脂质的明场图像（3a）和拉曼成像图（3b）。明场显微镜观察仍然无法判断脂质空间分布的不均匀性（图3a），但拉曼成像图谱可以看出不同相态的脂质在微米尺度上分布不均匀（图3b）。根据图3c中脂质光谱1和2的比较，aCH2拉曼峰（IaCH）的信噪比估值大于10。因此，拉曼光谱1和2之间的IaCH差异是显著的。

图3 -25℃甘油溶液中冷冻的卵母细胞中脂滴的拉曼光谱图（图源：[1]）

注：（a）卵母细胞内明场显微镜图像；（b）有序（青色）和无序（红色）状态下脂质的拉曼图谱；（c）（b）图拉曼成像中不同代表点处的拉曼光谱，1-有序脂滴区；2-无序脂滴区；3-细胞质。（d）C-H键拉伸区域对应光谱，1-有序脂质、2-无序脂质、3-细胞质。 

图4显示了在-25℃丙二醇溶液中冷冻的卵母细胞内部有序（IOL）和无序（IDL）相状态的脂质的明场图像（4a）和拉曼图（4b和4c）。SC的差异与甘油和PG的拉曼光谱不同有关，因为甘油拉伸CH带的拉曼光谱在2890、2945 сm-1处仅包含两个明显峰，而PG光谱中在2885、2940、2980 сm-1处有三个峰。值得注意的是，在第二个实验中的平均脂质有序度更高，达到0.31，这种差异是违反常识的，因为长时间暴露于低温有助于相变达到更稳定状态，因此，第一个实验应该具有更高的脂质有序度，而这种脂质有序度偏差的原因可能是实验中卵母细胞的来源不同，或者测量中使用的两个卵母细胞是在不同时间、不同的猫获得的，因此可能具有不同的脂质含量；另一个原因可能来自NMF-ALS方法的系统误差，可以注意到，光谱分量SOL和SDL在图3和图4中也有所不同。

图4 在-25℃ PG溶液中冷冻的猫卵母细胞中脂滴的拉曼图（图源：[1]）

注：（a）冷冻卵母细胞的明场显微镜图像，矩形为用拉曼光谱研究的区域；(b)有序（IOL青色）和无序（IDL，红色）状态下的脂质拉曼图；(c)η的空间分布；(d)多变量分析得出的拉伸CH区域中的光谱成分（SOL–有序脂质，SDL–无序脂质，SC–细胞质）；(e)脂质有序度η分布直方图。

3、拉曼光谱用以监测冷冻卵母细胞内脂质相状态变化

为评估脂质相状态的变化，研究中定义了脂质有序度：η=IOL/（IDL+IOL)。对所有光谱中脂质强度超过最大值的20%（图5）进行统计。图中脂质有序度分布广泛，可以使用正态分布来描述，其平均值η=0.18，这种分布的单峰性表明脂质处于有序和无序状态的区域逐渐分离（图5a）。图5b所示的η的空间分布证明了从0到0.4不等的具有不同脂质有序度的脂质共存，η的中间值可能由于深度分辨率不足以检测隐藏在某类脂质有序度脂质后的其它有序度脂质。

图5 图2所示拉曼图的η直方图（a）和空间分布（b）（图源：[1]）

4、“指纹区”拉曼光谱成像揭示脂滴内部不饱和脂质分布 

通过测量1000-2000 cm-1的“指纹”光谱区域，虽然脂质在该区域的拉曼光谱特征峰比CH拉伸带的峰强度低了约4倍，但是该指纹区域却包含了更多物质的拉曼谱带可以提供其它化学成分的有效信息。

研究发现，有序相状态的脂质会分布在LD的边界上，并形成环状结构，而无序状态的脂质主要位于LD的内核中。在图6a（见标记区域）中，可以识别出至少10个具有环状结构的LD。研究以1660cm-1位置处的不饱和脂质中C=C键和1745cm-1的C=O键比值表示不饱和脂质度的空间分布，由图6中的可视化结果显示，其平均IC=C/IC=O比率为6.05，对应于每个烃链约1.2个双键（图6b）。拉曼光谱对三个组分的分解并表征有序脂质、无序脂质和细胞质蛋白与冷冻保护剂混合物的贡献（图6c）。IC=C/IC=O比率从5（每条链约1个双键）到6.8（每条链约1.35个双键）（图6d），分析结果与实际预估一致。

图6 从指纹光谱区域获得的在-25℃条件下冷冻在PG溶液中的卵母细胞中脂滴的拉曼谱图（图源：[1]）

注：（a）有序状态的脂质拉曼图（IOL）；(b)IC=C/IC=O比率的空间分布；(c)多变量分析得出的指纹区域中的光谱成分；(d) IC=C/IC=O比率分布的直方图。 

此项研究使用显微拉曼光谱成像技术来揭示了冷冻过程中卵母细胞内LD的脂质相分离现象。并使用甘油和丙二醇作为冷冻保护剂进行卵母细胞冷冻实验，实验结果证实脂质在LD内按照不同脂质不饱和度进行分布，研究数据还表明，饱和脂质可能在LD表面发生LPT，而不饱和脂质是在LD核心处保持着无序的液相状态。

在许多哺乳动物中，LD会影响细胞活性，细胞内脂质的增加量是胚胎冷冻保存成功的主要限制。尽管几十年来已经研究了高脂质含量的卵母细胞和植入前胚胎的冷冻保存问题，但富含脂质的卵母细胞和胚胎的冷冻损伤研究仍然很少。在温度升高到LPT开始以后的脂质重新分布对细胞的作用仍不清楚。在有序相熔化后，LD内的大多数脂质很有可能都混合到均匀的混合物中。然而，冷冻后混合脂质所需的时间是未知的，需要更多的研究来揭示脂质再分布的不同方面及其对冷冻保存后细胞存活和发育的影响。脂质再分配的作用可以在细胞解冻后立即在细胞存活和脂质代谢中发挥重要作用。拉曼光谱似乎是研究生物细胞中LPT的一种前瞻性方法，可提供有关微米级脂质分布的信息。此项研究证明拉曼为研究与LD相关的低温损伤机制以及制定减轻这些损伤的策略开辟了新的可能性。

参考资料：

[1]Mokrousova VI, Okotrub KA, Amstislavsky SY, et al. Raman spectroscopy evidence of lipid separation in domestic cat oocytes during freezing. Cryobiology. 2020 Aug;95:177-182. doi: 10.1016/j.cryobiol.2020.03.005. Epub 2020 Mar 11. PMID: 32171795.