微流控芯片技术及其在生物医学中的应用
2018-08-14 佚名 转化医学网
众所周知，常规PCR需要制样、扩增及检测等步骤，既费时又费力，而当用微流控芯片进行PCR扩增及相关检测时，则可大大简化操作步骤、显著提高检测效率。
一 引言
生化反应芯片的功能就是把在普通实验室中进行的生化反应实验缩微到一块小小的芯片上来完成。目前报道的生化反应芯片主要包括聚合酶链反应(Polymerize Chain Reaction，PCR)芯片、药物合成芯片等，其中PCR芯片是生化反应芯片的典型代表。众所周知，常规PCR需要制样、扩增及检测等步骤，既费时又费力，而当用微流控芯片进行PCR扩增及相关检测时，则可大大简化操作步骤、显着提高检测效率。1993年Northrup等人以硅片和玻璃为基质材料首次报道了一种PCR芯片，并通过实验证明了PCR芯片可行性。该芯片的反应室刻蚀在硅片中，体积约为几微升，加热器也直接集成在芯片上，与传统的PCR相比，在相同扩增效率下，该芯片的热循环效率快2~ 10倍。我们实验室利用MEMS技术在硅片上研制出了一种PCR芯片，并实现了PCR扩增反应，芯片加热器和温度传感器都全部集成在芯片上，该芯片的最大升温速度是15℃/s，降温速度为15℃/s，为了使芯片系统达到智能化控制的目的，我们还开发出了相应的热循环控制器，实物图如图2所示。为了进一步提高PCR芯片的热循环速度，Kopp M U等人发展了一种连续流动式的PCR芯片，流动式芯片下面有95℃、72℃、60℃三个不同的恒温区间，当样品流经它们时就会实现自动变温，在流动中完成变性、退火和延伸反应，达到PCR扩增的目的。
二 微流控芯片发展历史
微流控芯片的发展历史最早可以追溯到1975年，Terry等人在一块硅片上加工出了一种气相色谱芯片，它由一个注液阀门和一个1.5m长的分离柱组成，能在几秒钟内对混合物进行分离。但是由于当时分离技术相对落后以及缺乏对类似器件的操作经验，整个科学界对这项划时代的工作响应寥寥。直到1990年，瑞士科学家Manz与Widmer首次提出了微全分析系统(Micro-Total Analytical System，μTAS)概念，当时这一概念是作为一种新型的化学传感器提出来的，其目的是为了提高分析能力而不是减小尺寸，但这个概念被提出之后，研究者们很快意识到器件尺寸的减小会带来很多的好处。自1992年开始，以毛细管电泳为主要应用对象的各种微流控芯片相继开发成功，从此科学界和产业界都纷纷介入到这一新兴领域的研发，研究者们开始对μTAS的各个相关领域进行了更加系统深入的研究，许多国家投入巨资支持μTAS的基础与应用研究，同时各种新方法、新工艺、新材料也不断地获得开发和应用，许多世界著名仪器公司包括安捷伦、岛津、日立等都有相应的产品和系统投入市场。
微流控芯片(Microfluidic Chip)是指通过微电子机械系统(Micro-electro-mechanical Systems，MEMS)技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析单元和系统，以实现对无机离子、有机物质、蛋白质、核酸以及其他生化组分的准确、快速和大信息量的检测。它是最近十几年来在微电子技术、生物技术、化学技术等多学科交叉的基础上发展起来的一种新型生化检测技术。实质上讲，微流控芯片就是一种微型化了的生化分析仪器，微流控芯片发展的最终目标是实现生化样品的微全分析，即把样品处理、生化反应和结果检测等三个典型的步骤全部集成在微芯片上完成。它已经广泛应用于生物医学、高通量药物合成筛选、食品卫生和环境监测等诸多领域。由于它具有成本低、高通量、分析过程自动化、分析速度快、试剂消耗少、易于集成化等优点，目前已经成为分析学科领域最活跃的发展前沿，代表着未来分析仪器走向微型化、集成化的发展方向。
广泛来说，当前生物芯片主要分为微阵列芯片和微流控芯片两种类型，前者是以静态亲和杂交技术为基础，主要有基因芯片、蛋白质芯片等形式，目前已经深度产业化；后者是以微流体控制技术为基础，主要有毛细管电泳芯片、PCR反应芯片等形式，开始由应用基础研究向产业化过渡，所以无论是在技术领域还是在商业领域，其竞争都已经趋于白热化。由于微流控芯片是以微全分析为主要目标，所以它表现出了更为诱人的应用前景。微流控芯片实验室的早期形式是芯片毛细管电泳，直到如今，毛细管电泳芯片仍是微流控芯片中分离部分的主体和研究热点，并且也是微流控芯片领域中最先实现商品化的一类芯片。
为了促进微全分析系统各研究领域的学者进行交流，首届国际微全分析系统学术会议于1994年在荷兰Enschede举行；我国于2002年7月在北京举行了首届全国微全分析系统会议，并于2004年4月将在杭州举行第二届会议，这一切都表明微全分析系统的研究已经进入了一个飞速发展的阶段。Forbs(《福布斯》)杂志将微流控芯片技术列为15件影响人类未来的最重要的发明之一。最近德国《经济周刊》在预测2004年有可能引起人们生活发生重大改变的十项实用新技术时表明：医学诊断型生物芯片位居第七位，其在2002年的市场销售额为10亿欧元，预计2005年销售额将达30亿欧元，至此，微流控芯片技术作为本世纪最重要的前沿技术之一逐渐被认可。
三 微流控芯片研究中的相关技术
1. 微流控芯片的基质材料
基质材料是微流控芯片的载体，在微流控芯片发展的初期，硅材料作为构建微流控芯片的首选材料而被广泛使用，这主要归因于业已成熟的半导体技术。但是随着研究的不断深入和应用领域的不断拓展，它表现出了不同程度的局限性：硅材料属于半导体，不能承受高电压，此外，硅材料不透明，与光学检测技术不兼容。玻璃材料具有很好的电渗性质和优良的光学性质，无论是从其物理性质还是化学性质来讲，都非常适合于微流控芯片的制作，但是它的光刻和蚀刻技术工艺复杂、费时，制作成本过高，这些因素制约了玻璃微流控芯片的应用和推广。因此，研究者们开始把更多的注意力转向了原材料便宜、加工制作简单的高分子聚合物，目前，以聚二甲基硅氧烷(PolydiMethyl-Siloxane，PDMS)为代表的有机高分子聚合物已成为微流控芯片研究的热点，PDMS表现出了非常理想的材料特性：良好的绝缘性，能承受高电压，已广泛应用于各种毛细管电泳微芯片的制作；热稳定性高，适合加工各种生化反应芯片；具有很高的生物兼容性和气体通透性，可以用于细胞培养；同时具有优良的光学特性，可应用于多种光学检测系统；弹性模量低，适合于制作微流体控制器件，如泵膜等。此外，PDMS还可以和硅、氮化硅、氧化硅、玻璃等许多材料形成很好的密封。此外，较常用的高分子聚合物还包括聚甲基丙烯酸甲酯(PolyMethylMethAcrylate，PMMA)、聚碳酸酯(PolyCarbonate，PC)等。
2. 微流控芯片的加工技术
微细加工技术是微流控芯片发展的前提条件，微流控芯片的制作技术首先起源于制造半导体及集成电路芯片所广泛采用的光刻(Lithography)和蚀刻技术(Etching)，目前已经广泛地用于硅片、玻璃和石英等基质材料上微流体网络的制作。其微制造工艺为：首先通过光学制板照相技术制备包括微流控芯片图案的掩模，制备好的掩模通常是镀有铬层的石英玻璃板；然后用甩胶机均匀地在芯片表面涂敷一层光刻胶，在紫外光下进行曝光，显影。上述工作完成之后，用相应的腐蚀剂对芯片进行蚀刻，蚀刻完成后，去除剩余的光刻胶便可获得所需的芯片微细结构。该方法工艺周期长、制作成本高，但其微加工技术非常成熟。
与硅片、玻璃材料不同的是，可用于微流控芯片加工制作的高分子聚合物种类繁多，而且各材料之间的物理化学性质差别很大，所以它们的微加工技术表现出了一定的多样性，目前主要有模塑法、热压法、LIGA技术、激光烧蚀技术和软光刻法等。模塑法(Injection Molding)是指通过光刻掩模技术制得凸起的微流控芯片阳模，然后在阳模上浇注液态的高分子聚合物，当高分子聚合物完全固化后将其与阳模剥离即可得到具有微流体网络的基片，适宜采用模塑法的高分子材料应该具有很低的黏度和很低的固化温度，如PDMS，环氧树脂，聚四氟乙烯等材料。热压法也是一种需要阳模的微流控芯片制造技术，该技术主要利用了高分子聚合物的玻璃转化温度。与模塑法相比，热压法制得的微通道重复性较差，而且管道易产生变形，操作条件相对苛刻。该方法主要应用于热塑性材料的加工，如PMMA和PC等。激光烧蚀(Laser Ablation)是一种新型的微细加工技术，它是通过紫外激光降解高分子聚合物，适宜激光烧蚀加工的材料有PMMA、聚苯乙烯、硝化纤维等。
3. 微流控芯片的微流体控制技术
微流体操纵技术是微流控芯片技术中最重要的一个研究领域之一，通过各种机械或非机械力实现对流体的驱动和控制。依据微流体驱动体系中有无机械活动部件，可以将其分为机械和非机械驱动系统，机械驱动系统主要包括压电微泵、静电微泵等，它主要是通过静电、压电等不同方法来触发引起的机械部件的运动，从而为微流体提供动力源，这种泵的优点是任何流体都可以推动，但其所驱动的流体呈脉冲状而不是连续式的。非机械驱动系统主要包括电渗泵、热毛细管泵等，其中电渗泵是微流控芯片系统中最常用的一种驱动力，相对于微机械压力驱动的泵来说，电渗泵有很多优点：如电渗泵易于制作而且没有任何移动部件，电渗泵的样品柱只有少量的扩散，此外，可以采用改变微通道壁x(电势)的方法来进一步控制电渗流的量和方向。
4. 微流控芯片检测技术
微流控芯片的结构特征决定了其检测技术的特殊性，与传统检测仪器相比，微流控芯片对其检测系统提出了更高的要求，如要求灵敏度高、响应速度快、具有平行分析功能和便携式特征等，目前基于不同原理的很多检测技术都已经应用到微流控芯片的研究中，主要有光学检测、电化学检测、质谱等方法
a. 光学检测
光学检测是微流控芯片检测方法中应用最广的一种，其优点在于灵敏度高、实用性强，且检测器与分析对象不需直接接触。其中激光诱导荧光检测(Laser Induced Fluorescence，LIF)是目前最灵敏的检测方法之一，其灵敏度达到10-9mol/L~10-12mol/L，对于某些荧光效率高的分子，其检测能力可以达到单分子水平，因此它也是当前商品化微流控系统中唯一被采用的检测器。但该检测设备价格昂贵，而且体积庞大，与微尺寸的微流控芯片极不匹配，一定程度上限制了其广泛推广与应用。
b. 电化学检测
基于电化学检测原理的检测系统可以说是最完整的、最集成、最理想的芯片检测系统之一，这主要有两方面的原因：一方面，微电极的制造技术与当前微流控芯片的加工工艺是完全兼容的，可以实现大批量生产；另一方面，电化学检测具有灵敏度高、选择性好、不受光程和样品浑浊度影响等优点，且只需要极少的外围辅助设备即可实现快速检测，图1给出的是一种便携式电化学检测系统。无疑，基于电化学原理的芯片检测技术代表未来芯片检测器的一个重要发展方向，显示了巨大的应用价值和潜力。
c. 质谱检测
质谱检测技术作为生物化学分析的重要手段，由于能够提供试样组分中生物大分子的基本结构和定量信息，所以在微流控芯片检测器中表现出了巨大潜力，但当前质谱检测的瓶颈在于质谱仪与微流控芯片的接口问题。
四 微流控芯片在生物医学领域中的一些应用
从微流控芯片的分析性能看，其未来的应用领域将十分广泛，并且其应用领域仍在不断地拓展之中，但目前的重点显然是在生物医学领域。除此之外，高通量药物合成与筛选、环境监测、食品卫生、刑事科学及国防等方面也会成为重要的应用领域。现仅就微流控芯片在生物医学领域的应用举三个例子说明微流控芯片系统的巨大潜力：
1. 毛细管电泳分离
毛细管电泳芯片是微流控芯片中发展最早、也是发展最快的一项芯片技术，目前已经成为微流控芯片领域中最令人瞩目的一个分支，与传统的毛细管电泳相比，它具有自动化程度高、样品消耗少、分析速度快以及高通量等特征，在对DNA片段、多肽、蛋白质等生物大分子的分析中，它表现出了超强的分离分析能力，它被认为是后基因时代中最有希望攻克蛋白质研究、基因临床诊断等科学难题的分离分析手段之一。1992年Manz A发表了第一篇有关毛细管电泳芯片的论文，该文以荧光染料为分析对象，以电渗流作为流体驱动力，在芯片微流体网络中成功地实现了流体控制，向人们展示了毛细管电泳芯片的雏形和其优越的分离分析能力，这一研究成果引起了学术界的广泛关注和兴趣，相继各种用于氨基酸、蛋白质、药物等分离的芯片也不断开发成功。为了进一步提高芯片的分析能力，Mathies领导的研究小组最近在直径为200mm的圆盘玻璃芯片上集成384个毛细管电泳微通道，其有效分离长度达到了8cm，对100bp(base pair，碱基对)~1000bp的基因标准标记物达到了优于10bp的分辨率，并在该芯片上完成了1163D变异基因的PCR-RFLP(限制性片断长度多态性)分析，为临床诊断提供了依据。我们实验室研制出了一种新型结构的PDMS电泳微芯片，并已经在自行研制的LIF检测系统上完成了对氨基酸、PCR markers(标记物)的电泳分离，临床应用实验也正在进行之中。
毛细管电泳微芯片是微流控分析芯片中产业化程度最高、也是最先实现商品化的一类芯片，早在1999年，美国惠普(现为安捷伦)与Caliper Tech-nologies公司联合研制的第一台微流控芯片商品“2100生化分析仪”就已经开始投放市场，该系统使用CAliper公司生产的玻璃芯片，采用LIF进行检测，并配了5~6种试剂盒配合使用，可对DNA、RNA片段及蛋白质等进行电泳分离检测，玻璃芯片尺寸为1.8cm×1.8cm，有效分离长度约1.6cm，30min可同时完成12个样的分离检测。与传统的基因和蛋白质电泳相比，芯片毛细管电泳无需样品的走胶、染色、脱色工序，无需干燥和照相等烦琐耗时的步骤，同时快速测试多个试样，获得基因和蛋白质的电泳图和曲线。整个测试过程简化为快速、简易的三个步骤：装载样品、进行分析、观察数据。
2. 基因测序
毛细管电泳的一个重要应用领域是基因测序，正是因为96根毛细管电泳阵列仪广泛地应用于人类基因组计划的测序工作之中，才使举世瞩目的人类基因组计划的进程大大加快，使之由原定的2003年提前到2000年基本完成。事实上，从基因测序的原理来讲，芯片毛细管电泳测序和普通毛细管电泳测序是完全一致的，但前者表现出了更大的优越性：首先由于芯片毛细管电泳独特的注样方式和更细的分离通道，所以它能实现DNA的快速分离；另一方面微流控芯片采用了半导体工业中成熟的微加工技术进行制造，所以一块芯片上可以集成更多的毛细管，实现高通量测序；最后由于它实现了产物处理和分析的集成化，减少了人为干扰，因此更进一步地降低了操作成本。
Mathies领导的研究小组早在1995年就开始在微流控芯片上开展了DNA测序工作，他们在一块有效分离长度为3.5cm的芯片上测序了150个碱基，他们利用芯片变性毛细管电泳在10min之内就完成了对433个碱基序列的测定。该测序芯片的毛细管长度为3.5cm，横切面尺寸50μm×8μm。为了进一步提高DNA测序能力，到2001年他们在直径为150mm的圆形玻璃芯片上，刻蚀出了96个呈辐射型排布的毛细管电泳通道阵列，由于芯片采用旋转扫描LIF法进行检测，所以可实现平行测序，测序达500碱基。
3. PCR反应
微流控芯片目前已经成为生物医学领域研究的前沿和热点，因为它从根本上改变了传统生化分析的方式和效率，它将具有广阔的应用前景和极富潜力的应用价值。随着微流控芯片制作技术的不断成熟和各种新型材料的不断开发，微流控芯片的功能将更为完备、集成化程度将更高。以微流控芯片为核心的微全分析系统将使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭，可以预见，在不久的将来一种随身携带用于监测人体健康状况的“掌上型实验室”将开发出来，通过无线通信技术，甚至可以实现远程诊断。总之作为一种高度集成化、微型化以及智能化的生化分析仪器，微流控芯片将对人类的生活产生极其广泛、深远的影响，甚至可能会给生命科学领域和生化分析领域带来一场革命。
另外，一旦把PCR芯片与毛细管电泳芯片二者集成起来的时候，其优势就显得更为明显。Lagally E T等人在玻璃芯片上制作了集阀门、疏水孔、PCR反应池以及毛细管电泳(Capillary Elec-trophoresis，CE)于一体的芯片系统，PCR反应池体积是280nL，PCR扩增前所需模板浓度为20拷贝/mL，反应室中平均仅为5~6个DNA模板分子，加热器和热电偶集成在芯片的背面，10min即可完成20个循环。反应完成后，PCR反应产物在电渗泵的驱动下进入毛细管电泳芯片中，进行在线CE分离分析。该芯片系统集取样、PCR扩增和CE分离于一体，节省了试剂消耗、加快了分析速度，同时也避免了实验操作中的人为污染。
五 结论与展望
微流控芯片目前已经成为生物医学领域研究的前沿和热点，因为它从根本上改变了传统生化分析的方式和效率，它将具有广阔的应用前景和极富潜力的应用价值。随着微流控芯片制作技术的不断成熟和各种新型材料的不断开发，微流控芯片的功能将更为完备、集成化程度将更高。以微流控芯片为核心的微全分析系统将使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭，可以预见，在不久的将来一种随身携带用于监测人体健康状况的“掌上型实验室”将开发出来，通过无线通信技术，甚至可以实现远程诊断。总之作为一种高度集成化、微型化以及智能化的生化分析仪器，微流控芯片将对人类的生活产生极其广泛、深远的影响，甚至可能会给生命科学领域和生化分析领域带来一场革命。
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