【期刊导读】机制新发现：鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）增强干扰素α介导的抗HBV活性

编者按

目前，慢性乙型肝炎（HBV）感染仍然是全球重大公共卫生问题，尽管基于聚乙二醇干扰素α（PEG IFNα）的治疗已被证明可提高慢乙肝患者的临床治愈率，但其作用机制仍然是当前研究的热点。深入研究PEG IFNα在抗HBV感染中的作用机制，对于优化其治疗策略，进一步提高慢乙肝的临床治愈率具有重要意义。

鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）属于鸟苷酸结合蛋白家族，是一种干扰素诱导蛋白。已有研究表明，GBP1在细胞的抗病毒应答中发挥重要作用，但GBP1在HBV感染中的作用尚不明确。近日，重庆医科大学附属第一医院秦波教授团队发表的研究成果表明，GBP1水平在HBV感染患者中升高，GBP1可抑制HBV复制、促进HBsAg清除，其表达水平与PEG IFNα-2b介导的抗HBV免疫应答呈正相关。

研究方法

01 细胞模型

选用HepG2-NTCP和HepG2 2.15细胞系，用于研究病毒复制和抗病毒药物的作用。通过转染技术，过表达或沉默GBP1基因。在细胞转染后，加入1000 U/ml Peg IFNα-2b，培养一定时间后收集细胞和上清液，定量分析GBP1和HBV相关标志物（HBsAg、HBeAg、HBV RNA等）的表达水平。并且分析了GBP1与HBs亚蛋白的相互作用及可能的作用位点。

02 临床样本分析

2020年10月至2022年10月，于重庆医科大学附属第一医院感染科招募68例接受Peg IFNα-2b治疗的成年慢乙肝患者，分为治疗组（n = 34）和临床治愈组（n = 34），同时纳入17例健康对照者。分别在治疗前（基线）、治疗后3个月和6个月以及临床治愈时收集血样进行HBV标志物和肝功能检测，并分别使用ELISA和qRT-PCR技术测定血清和外周血单核细胞（PBMC）中的GBP1水平。

研究结果

一 细胞学水平

01 HBV感染上调GBP1表达

首先在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中检测GBP1的mRNA和蛋白水平。结果显示，HBV感染显著上调了GBP1蛋白水平（p < 0.05，图1B），但对mRNA水平影响不大。尽管HBV RNA在感染60小时后下降，但GBP1 mRNA和蛋白水平以及HBs蛋白水平波动不大（图1C - 1F）。以上结果表明，HBV感染可上调GBP1的表达。

图1 HBV感染上调GBP1的表达

A）通过qRT-PCR检测未感染和感染HBV的HepG2-NTCP细胞中HBV RNA和GBP1 mRNA的水平；

B）通过Western blot检测未感染和感染HBV的HepG2-NTCP细胞的GBP1和HBs蛋白表达；

C - F）HBV感染不同时间点HBV RNA（C）、GBP1 mRNA（D）、GBP1（E）、HBs蛋白（F）的变化。****p < 0.0001

02 GBP1可增强Peg IFNα-2b的抗HBV功能

为进一步探讨GBP1介导的Peg IFNα-2b抑制HBV感染的机制，研究使用hGBP1质粒和（或）Peg IFNα-2b处理HBV感染细胞，分别为空白对照组（A组）、Peg IFNα-2b处理组（B组）、hGBP1质粒处理组（C组）、GBP1和Peg IFNα-2b联合处理组（D组）。结果显示，B、C、D组的HBsAg和HBeAg水平均下降（图2A）。HBV RNA在B、C、D组中显著低于A组，而GBP1 mRNA在B、C、D组中显著上升（图2B和2C）。此外，与A组相比，B、C、D组中GBP1蛋白水平升高，而HBs蛋白水平下降（图2D和2E）。以上结果表明，GBP1具有抗HBV感染的作用，且IFNα治疗可以增强其抗病毒活性。

图2 GBP1增强了IFNα的抗病毒功能

A）通过ELISA测定HBV感染的HepG2 2.15和HepG2-NTCP细胞中的HBsAg和HBeAg含量；

B - C）HBV感染细胞中HBV RNA（B）和GBP1 mRNA（C）水平的变化；

D–E）HBV感染细胞中的GBP1（D）和HBs蛋白（E）水平。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

03 GBP1沉默促进HBV复制

为了进一步验证假设，研究使用si-GBP1-1、si-GBP1-2特异性沉默HepG2 2.15细胞中的GBP1表达。结果显示，与对照组相比，沉默GBP1增加了HBsAg和HBeAg的分泌（图3A），沉默GBP1组中GBP1 mRNA和蛋白表达降低，而HBV RNA和HBs蛋白表达上调（图3B和3C）。

为了更好地理解GBP1在Peg IFNα-2b抗HBV感染中的作用，研究将hGBP1质粒或si-GBP1转染到HepG2 2.15和HepG2-NTCP细胞中，然后与Peg IFNα-2b共同处理。结果显示，GBP1过表达抑制了HBsAg和HBeAg的产生，降低了HBV RNA和HBs蛋白水平，并增加了GBP1表达，而沉默GBP1则抑制了GBP1对病毒感染的作用并减少了GBP1表达（图3D-3I）。同时，研究结果显示，GBP1沉默的细胞在经过Peg IFNα-2b处理后部分恢复了GBP1 mRNA和蛋白表达，并恢复了其对HBV的抑制作用（图3D-3I）。这些结果进一步表明，GBP1在调节IFNα诱导的免疫应答中起到积极作用。

图3 GBP1沉默促进了HBV复制

A - C）用特定siRNA转导HepG2 2.15细胞并采用ELISA（A）、qRT-PCR（B）和Western blot（C）检查指示基因的表达；

D - F）使用hGBP1质粒或si-GBP1转染HepG2 2.15或HepG2-NTCP细胞，然后用IFN-α刺激，并采用ELISA（D、G）、qRT-PCR（E、H）和Western blot（F、I）检查指示基因的表达。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

二 临床样本分析

01 GBP1水平在HBV感染患者中升高，且与Peg IFNα-2bα治疗的疗效呈正相关

对临床样本的研究发现，临床治愈组和治疗组基线、3个月和6个月的GBP1表达水平均显著高于健康对照组（p < 0.05），但治疗组与临床治愈组之间无显著差异（p > 0.05）（图4B）。治疗组患者的基线GBP1 mRNA水平略低于健康对照组，但在治疗3个月后显著升高（p < 0.05），6个月后升高趋势有所减缓但仍高于基线水平（图4A）。进一步通过Spearman相关分析发现，治疗3个月时的GBP1 mRNA水平与患者的早期应答评估一致（图4C）。

图4 IFNα治疗患者和健康对照者外周血中GBP1的表达

A - B）IFNα治疗患者和健康对照者中GBP1 mRNA（A）和GBP1（B）的相对表达水平；

C）IFNα治疗患者中GBP1水平与IFNα疗效之间的相关性。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001

以HBsAg是否快速下降（12或24周时HBsAg < 200 IU/ml 或下降> 1 log ₁₀ IU/ml）作为早期应答标准，将患者分为早期应答组和无应答组。结果显示，治疗3个月时，早期应答组的GBP1 mRNA水平显著高于无应答组（p < 0.05），6个月时差异减少，但应答组的GBP1 mRNA水平始终高于无应答组（图5A）。早期应答组的血清GBP1水平亦高于无应答组，尽管无显著统计差异（图5B）。

研究还评估了将GBP1单独及与其他指标结合用于预测IFNα治疗早期应答的价值。结果表明，相较于基线，治疗后3个月和6个月时的GBP1及其mRNA水平对预测IFNα早期应答具有显著的诊断价值，尤其在6个月时，结合GBP1、GBP1 mRNA、HBsAg、ALT、AST和WBC水平的预测准确性更高（图5C和5D）。

图5 GBP1在早期无应答和应答患者中的表达及其诊断和预后价值

A - B）无应答和应答患者中GBP1 mRNA（A）和GBP1（B）的相对表达水平；C）ROC曲线评估GBP1的诊断和预后价值；

D）ROC曲线评估GBP1与其他指标联合诊断和预后价值

肝霖君有话说

本研究首次揭示了GBP1在IFNα介导的抗HBV活性中的关键作用，为慢乙肝的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点，通过增强GBP1的表达或活性，可能有望提高现有IFNα治疗的效果，达到更高的临床治愈率。此外，GBP1作为宿主因子，不易引起病毒的耐药性，这一特点在长期抗病毒治疗中尤为重要。

除了GBP1，过往研究还发现其他与宿主免疫相关的基因和蛋白质也可能在抗HBV治疗中发挥重要作用。如骨髓基质抗原2（BST2）、三基序蛋白22（TRIM22）、TRIIM38等。未来还需系统地筛选和验证这些潜在的抗病毒因子，建立更为全面的抗病毒治疗策略，让更多慢乙肝患者获益。

参考文献：  

Li Y, Luo H, Hu X, et al. Guanylate-Binding Protein 1 (GBP1) Enhances IFN-α Mediated Antiviral Activity against Hepatitis B Virus Infection[J]. Polish Journal of Microbiology, 2024, 73(2): 217-235.