NEJM：高福院士发表新型冠状病毒感染肺炎论文

小编注：新型冠状病毒肺炎引发全球关注，学术界也不例外。今天NEJM和Lancet分别发表相关文章。下面是NEJM文章，Lancet文章见：Lancet：在线刊出8篇新型冠状病毒肺炎相关文章

2019年12月，2019年12月，一群原因不明的肺炎患者与中国武汉的海鲜批发市场有关。 通过对肺炎患者样本进行无偏测序，发现了以前未知的β冠状病毒。 人类气道上皮细胞被用于分离一种新型冠状病毒，命名为2019-nCoV，该冠状病毒在sarbecovirus亚属Orthocoronavirinae亚科内形成了另一个进化枝。 与MERS-CoV和SARS-CoV不同的是，2019-nCoV是感染人类的冠状病毒家族的第七个成员。 加强监视和进一步调查正在进行中。

冠状病毒是一种包膜的RNA病毒，广泛分布于人类，其他哺乳动物和鸟类中，并引起呼吸道，肠道，肝脏和神经系统疾病。2,3已知六种冠状病毒可引起人类疾病。4四种病毒-229E，OC43 ，NL63和HKU1是普遍存在的，通常在具有免疫能力的个体中引起普通的感冒症状。4其他两种菌株-严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）-起源于人畜共患病5 SARS-CoV是2002年和2003年中国广东省严重急性呼吸道综合症暴发的病原体。6-8MERS-CoV是造成广东省严重呼吸道疾病暴发的病原体。 2012年在中东。9鉴于冠状病毒的高度流行和广泛分布，其基因多样性和基因组的频繁重组以及人类与由于频繁的跨物种感染和偶然的外溢事件，在极小的界面活动中，新型冠状病毒很可能会在人类中定期出现

2019年12月下旬，几家当地卫生机构报告了一群原因不明的肺炎，这些流行病学与中国湖北省武汉市的海鲜和湿动物批发市场有关.11 2019年12月31日，中国疾病预防控制中心 疾病预防控制中心派出了一个快速反应小组，陪同湖北省和武汉市卫生部门开展流行病学和病因学调查。 我们报告了这项调查的结果，确定了肺炎簇的来源，并描述了在疾病爆发早期由中国疾病预防控制中心检测其标本的肺炎患者中检测到的新型冠状病毒。 我们还描述了其中两名患者的肺炎的临床特征。

从2019年12月21日或以后在武汉发现的，原因不明的肺炎患者中收集了四个下呼吸道样本，包括支气管肺泡灌洗液，这些样本在他们离开时已出现在华南海鲜市场临床表现。从北京医院因已知原因引起的肺炎患者中收集了七个支气管肺泡灌洗液样本作为对照样本。如制造商（Roche）所述，用高纯病毒核酸试剂盒从临床样品（包括用作阴性对照的未感染培养物）中提取核酸。根据制造商的说明，使用RespiFinderSmart22kit（PathoFinder BV）和LightCycler 480实时PCR系统，通过聚合酶链反应（PCR）对提取的核酸样品进行病毒和细菌测试.12根据分析，对样品进行了22种病原体分析（18病毒和4种细菌），如补充附录中所述。此外，先前所述的无偏，高通量测序[13]用于发现无法通过上述方法鉴定的微生物序列。如补充附录中所述，通过靶向泛β-CoV的共有RdRp区，使用实时逆转录PCR（RT-PCR）分析来检测病毒RNA。

三名患有严重肺炎的成年患者于2019年12月27日入武汉医院。患者1为49岁女性，患者2为61岁男性，患者3为32岁-岁的男人。患者1和2可获得临床资料。患者1报告于2019年12月23日无基础慢性疾病，但报告有发烧（温度37°C至38°C）和咳嗽伴胸部不适。疾病，咳嗽和胸部不适加剧，但发烧减少；肺炎的诊断基于计算机断层扫描（CT）扫描。她的职业是海鲜批发市场的零售商。患者2最初于2019年12月20日报告发烧和咳嗽;发病后7天出现呼吸窘迫，并在接下来的2天内恶化（见胸部X线片，图1），此时开始进行机械通气。他是海鲜批发市场的常客。患者1和3已康复，并于2020年1月16日出院。患者2于2020年1月9日死亡。未获得标本。

图1.胸片

新型冠状病毒的检测和分离

2019年12月30日，从武汉金银滩医院收集了3份支气管肺泡灌洗液样本。 。从患者的支气管肺泡灌洗液中提取的RNA用作模板，结合Illumina测序和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。从单个标本中获得了超过20,000个病毒读数，并且大多数重叠群与beta冠状病毒属B的基因组相匹配-与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，MG772933.1）的同一性超过85％基因组先前已发表。使用实时RT-PCR测定RNA靶向泛β-CoV的共有RdRp区也获得了积极的结果（尽管对于检测到的样品，其循环阈值高于34）。使用人气道上皮细胞以及Vero E6和Huh-7细胞株从临床标本中分离病毒。分离出的病毒命名为2019-nCoV。 

为了确定是否可以在2019-nCoV感染的人气道上皮细胞中看到病毒颗粒，接种后第6天每天用光学显微镜和透射电子显微镜检查模拟感染和2019-nCoV感染的人气道上皮培养物。 接种人气道上皮细胞表面层96小时后观察到细胞病变作用。 用光学显微镜在焦点中心观察到缺乏纤毛的跳动（图2）。 直到接种后6天，在Vero E6和Huh-7细胞系中都没有观察到特异性的细胞病变作用。

图2.人气道上皮细胞接种2019-nCoV后的细胞培养图片

负染法电镜下观察2019新型冠状病毒一般呈球形，但有些呈多形性（见图3）。直径在60-140nm之间。病毒颗粒有明显的棘突，大约9-12nm, 导致病毒呈现了日冕状。

图3.2019-nCoV在透射电子显微镜下图片

为了进一步确定病毒特征，对患者临床标本（肺泡灌洗液）和人类呼吸道上皮细胞分离到的病毒用Illumina和Nanopore 进行了测序分析。从这3位患者体内都分离到了新型冠状病毒。从肺泡灌洗液中获得了2个全长的冠状病毒序列（BetaCoV/Wuhan/IVDC- HB-04/2020, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2020|EPI_ISL_402121），和一位患者体内分离到的病毒全长基因序列(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119)。这3个新型冠状病毒全基因组序列已经上报给GASAID组织。(BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, accession ID: EPI_ISL_402119; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, accession ID: EPI_ISL_402120; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019, accession ID: EPI_ISL_402121)且86.9%核酸序列与之前报道过的蝙蝠体内分离到的SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)有高度一致性。这3个新型冠状病毒基因汇总形成了Sarbe冠状病毒亚属中的独立分枝，显示了典型的乙型冠状病毒属结构：一个5′非翻译区（UTR）、复制酶复合物（orf1ab）、S基因、E基因、M基因、N基因、3′UTR和几个未识别的非结构开放读码框。

尽管2019-nCoV与在蝙蝠中检测到的某些β-冠状病毒相似（图4），但它与SARS-CoV和MERS-CoV不同。 来自武汉的三种2019-nCoV冠状病毒与两种蝙蝠衍生的SARS样菌株ZC45和ZXC21共同构成了sarbecovirus亚种B系。 来自人类的SARS-CoV病毒株和从中国西南地区收集的蝙蝠的遗传相似的SARS样冠状病毒形成了sarbecovirus亚属内的另一个进化枝。 由于保守复制酶结构域（ORF 1ab）中的序列同一性在2019-nCoV和乙型冠状病毒的其他成员之间小于90％，因此2019-nCoV-武汉病毒性肺炎的可能病原体-是一种新的乙型冠状病毒，属于 冠状病毒科的sarbecovirus亚属。

图4.2019-nCoV和正冠状病毒亚科中其他乙型冠状病毒基因系统发育树分析图

我们报告了一种新的CoV（2019-nCoV），该病毒已于2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中鉴定出。该病毒的存在包括通过全基因组测序在三名患者的支气管肺泡灌洗液中进行鉴定，直接PCR和培养。该冠状病毒可能引起的疾病被称为“新型冠状病毒感染的肺炎”（NCIP）。完整的基因组已提交给GASAID。系统发育分析表明，2019-nCoV属于beta冠状病毒属，其中包括在人，蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒（SARS-CoV，蝙蝠SARS状CoV等）15。对其特定细胞病变效应和形态的初步描述。

分子技术已成功用于鉴定传染原已有多年。无偏倚的高通量测序是发现病原体的有力工具。14,16下一代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病暴发的方式，加深了我们对疾病发生和传播的理解，加速了对病原体的识别。病原体，促进数据共享。我们在本报告中描述了分子技术和无偏DNA测序的使用，以发现一种新型的β冠状病毒，它可能已在中国武汉的三名患者中引起严重的肺炎。

尽管建立人呼吸道上皮细胞培养物是劳动密集型的，但它们似乎是分析人呼吸道病原体的有价值的研究工具。14我们的研究表明，人呼吸道分泌物最初传播到人气道上皮细胞培养物中，然后是透射电子显微镜和培养物上清液的全基因组测序已成功用于可视化和检测新型人冠状病毒，这可能无法通过传统方法进行鉴定。

我们还需要进一步建立可准确、快速鉴别呼吸道未知病原体的方法。基于在此研究中得到的3条完整基因组，我们设计了几个针对2019-nCoV基因组的ORF1ab、N和E区域的特异和敏感的检测，可以检测出临床样本中的病毒RNA。引物集和标准操作程序已与世界卫生组织共享，用于在全球和中国监测和检测2019-nCoV感染。最新的数据显示，中国已有830人检测出2019-nCoV。

虽然我们的研究没有完全遵循科赫法则，但我们的分析提供了武汉暴发2019-nCoV的证据。我们还需提供有关2019-nCoV引起武汉疫情的其他证据，包括在患者的肺组织中用免疫组化方法检测到2019-nCoV抗原，从同一患者两个时间点的血清标本中检测出可证实血清转化的抗病毒IgM和IgG抗体，以及来自动物（猴子）实验的致病性证据。至关重要的是进行流行病学调查，以确定感染的传播方式、繁殖间隔期和感染的临床症状谱，从而为制定预防、控制和制止2019-nCoV传播的战略提供指导。

原始出处：

Zhu N,et al. A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019.NEJM,January 24, 2020 DOI: 10.1056/NEJMoa2001017