专家解读Cell丨实现大规模、高效、精准的基因编辑突变
2018-09-29 常兴 BioArt
自从发现DNA是遗传的物质基础以来， 分析基因型 (DNA序列的差异)和表型（细胞、模式生物乃至人类的个体间差异）的关系， 一直是遗传学乃至生物学研究的核心科学问题。如果可以通过高通量的方法分析这一问题，将极大地促进我们对基因功能、表达调控和及其与疾病之间的关系。利用shRNA、siRNA 以及近几年来迅速发展的CRISPR， 高通量的敲低/敲除基因的表达， 已经被广泛应用于高通量的研究基因功能。
自从发现DNA是遗传的物质基础以来， 分析基因型 (DNA序列的差异)和表型（细胞、模式生物乃至人类的个体间差异）的关系， 一直是遗传学乃至生物学研究的核心科学问题。如果可以通过高通量的方法分析这一问题，将极大地促进我们对基因功能、表达调控和及其与疾病之间的关系。利用shRNA、siRNA 以及近几年来迅速发展的CRISPR， 高通量的敲低/敲除基因的表达， 已经被广泛应用于高通量的研究基因功能。 但是， 和复杂性状、人类疾病以及生物进化最相关的遗传突变， 包括点突变 (SNP)、错义突变、以及非编码区突变等，往往不造成完全的功能缺失，并且很难预测其对表型的影响。但是，这些突变一直无法高效高通量的通过实验产生，大多数研究只能利用反向遗传学的方法，单个诱导突变，分析其表型。
现有的CRISPR方法，极大的方便了针对DNA的遗传操作。但因为受限于同源重组 (HDR) 的低效性，无法高效大规模产生精确的突变，用于遗传学研究。解决这一难题，主要有两种思路，其一，通过饱和突变的方法，随机产生突变，但这一方法只能局限于一小段DNA；其二，改进现有的HDR方法，提高其效率。
近日，来自斯坦福大学的Hunter Fraser课题组在Cell上发表了题为Functional Genetic Variants Revealed by Massively Parallel Precise Genome Editing的论文，就是通过上述第二种思路，在酵母细胞中针对两种酵母品系中存在的遗传差异，进行高通量分析对酵母适应性(存活和增殖)的影响。
首先，为了提高HDR的效率，作者开发了“CRISPEY” (cas9-retron precise parallel editing with homology)技术。过去的研究发现，HDR效率最高的模板是单链DNA， 并且如果单链DNA处于Cas9诱导的DNA断裂附近，可以提高HDR的效率。作者很巧妙的利用了细菌中存在的Retron系统（反转录酶操纵子，可以产生多拷贝单链DNA，然后与模板RNA共价连接），通过细胞内逆转录方式直接在细胞核内产生单链DNA， 并且和sgRNA共价连接。在酵母细胞中，与Cas9蛋白以及逆转录酶共表达后， sgRNA和HDR的修复模板 (逆转录后的单链DNA)可以同时被Cas9招募到DNA切割的位点，作者发现，这一方法可以诱导>80%以上的精确编辑，更重要的是，Cas9切割造成的Indel很少，提示这一系统中，HDR是主要的DNA双链断裂修复模式。进一步实验表明这一系统可以精确的插入~700bp的DNA序列。
而后，通过这一体系，作者系统分析了在两种酵母品系中有差异的SNP和small indels， 并且比较了诱导的突变对酵母细胞适应性的影响。在针对 16000个突变进行筛选后，发现很多影响酵母适应性的突变处于非编码区，尤其是promoter区域接近转录因子结合位点的地方。而在编码区的错义突变对酵母的影响反而影响较小。作者猜测主要原因在自然选择后，不同酵母品系中毒性大的错义突变数量较低。
如上所述，这篇文章开发了高效诱导HDR的方法，并且证明可以高通量的在酵母中进行遗传分析。因为Retron过去发现在哺乳动物细胞内也有效，作者猜测类似系统也可以在其他物种中成功，但因为DNA损伤修复以及HDR机制的差异，这一策略在哺乳动物细胞中的应用可能还需要进一步探索。
原始出处：
Sharon E, Chen SA, Khosla NM,et al.Functional Genetic Variants Revealed by Massively Parallel Precise Genome Editing.Cell. 2018 Sep 18. pii: S0092-8674(18)31118-8. doi: 10.1016/j.cell.2018.08.057. [Epub ahead of print]
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