bioRxiv：新冠病毒检测和研究的三种测序方法对比

随着新冠病毒的全球肆虐，如何在针对疑似样本的大规模检测中，既能提高检测灵敏度，又能获得病毒全基因组序列以用于后续变异监测和研究，中国科学家于2020年3月16日预印在bioRxiv的一篇文章《Multiple approaches formassively parallel sequencing of HCoV-19 genomes directly from clinical samples》给出了答案。

文章分别采用宏基因组测序（Meta）、探针捕获测序（Capture）和多重PCR捕获测序（Amplicon）等三种方法对8例梯度稀释的病毒培养物（Ct值17.3-39.9）和8例新冠病毒临床样本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液样本）进行了检测对比。首先采用宏基因组方法对临床样本进行了超高通量测序，每个样本产出>300Gb数据，其中病毒reads占总reads比例仅0.002%-5.513%。

样本数据量要求

在同时满足全基因组95%覆盖度以及10X测序深度的情况下：在病毒梯度稀释样本中(102-106copies/ml)进行探针捕获测序需要5.3Mb-14Gb数据，进行多重PCR捕获测序需要33Mb-973Mb数据；在临床样本中，进行探针捕获测序需要12Mb-25Gb数据，进行多重PCR捕获测序需要32Mb-1.8Gb数据，而宏基因组需要129Mb-334Gb数据。

表1一定深度下三种方法所需要的数据量

满足高要求下游分析的情况下(捕获≥20X，多重≥100X，宏基因组≥10X，覆盖度≥95%)，在病毒梯度稀释样本中(102-106copies/ml)，捕获需要8Mb-24Gb数据，多重需要185Mb-2.7Gb数据；在临床样本中，捕获需要23Mb-25Gb数据，多重需要261Mb- 1.8Gb数据，而宏基因组需要129Mb-334Gb数据。

表2满足下游深度分析三种方法所需要的数据量

通过对比可知，多重PCR捕获测序方法在不同病毒载量样本中所需要的数据量差异更小，在低病毒载量要求的数据量更少。

病毒载量检测灵敏度

采用华大智造SARS-CoV-2 full length genome panel试剂盒，对梯度稀释的病毒培养物（Ct值17.3-39.9）和临床样本（Ct值18-32，包括咽拭子，喉拭子，鼻拭子，肛拭子和唾液样本）进行检测对比，结果表明：对于高病毒载量（≥105copies/ml），探针捕获测序和多重PCR捕获测序都有很好的富集效果（相对于宏基因组方法分别获得了5596倍和5710倍富集）；而在低病毒载量的样本中（≤104copies/ml，Ct值≥28.7）多重PCR捕获测序的富集效果是探针捕获测序的10-1000倍。这一结果表示，在低病毒载量的情况下，多重PCR捕获测序具有更好的检测灵敏度。

#RPM-每M数据中病毒的数据的比例

图1三种方法对病毒富集的效果

突变检测准确性

在临床样本中，基于多重PCR捕获测序和宏基因组测序方法都检测到19个突变位点，而探针捕获测序只检测到18个位点，漏检一个点，并且该位点对应的样本病毒载量低（Ct 值30）。这一结果表明多重PCR捕获测序方法相对更为准确，特别是在极端样本情况下。

图2 三种方法突变检测结果

结论

综上，基于高通量测序的三种方法选择指导：

1.如果研究者想要研究除目标微生物外其他的病原微生物，并且病毒载量≥ 105copies/ml或Ct值≤ 24.5，推荐宏基因组测序；2.如果研究者只想研究目标微生物，比较有挑战的样本譬如病毒载量<105 copies/ml或Ct值>24.5，推荐探针捕获测序(关注次要碱基突变和碱基频率)和多重PCR测序（关注主要碱基突变）；3.如果研究者只想研究目标微生物，并重点关注主要碱基突变，样本极具挑战性，病毒载量低至102copies/ml或Ct值高至35，推荐多重PCR测序。

目前，针对以上三种方法，华大智造DNBSEQ平台均已推出配套整体解决方案。特别地，在该文中采用的SARS-CoV-2 full length genome panel试剂盒基于华大智造ATOPlex多重定制化服务平台打造。该试剂盒除了应用于全基因组组装、病毒变异检测、进化研究外，还能够应用于极端新冠样本的检测，最低仅需1M Reads就可获取病毒全基因组信息，其表现出比常规RT-PCR更高的灵敏度，能够满足RT-PCR假阴性样本的二次检测、复核确诊和大规模疑似样本检测的需要。

关于SARS-CoV-2 full length genome panel试剂盒

基于锁定引物的2步PCR，特异性强，中间不需要额外的消化步骤，操作简单；能够在一管中实现病毒全基因的扩增，不需要分管操作；加入已知拷贝数人工合成外参DNA，并同时进行病毒基因和外参DNA的检测，用于病毒的载量确定；加入看家基因检测，可以用于病毒载量相对于细胞含量的确定，有助于病毒细胞病理学研究；双唯一barcode结合DNBSEQ测序，最大程度降低barcode串扰，降低平行测序过程中强阳性样本对弱阳性或阴性样本的污染。

关于ATOPlex多重PCR定制化服务平台

ATOPlex多重PCR定制化服务平台是华大智造自主研发的以超高重PCR技术为核心的产品定制平台。该平台涵盖了DNA、RNA和DNA甲基化方向，可以满足科研、医药、司法、农业、DTC等相关领域的个性化基因检测产品定制。ATOPlex多重PCR定制产品平台提供产品设计、建库试剂，此外，还可以提供该产品基于MGISP-100或者MGISP-960的自动化建库解决方案。

原始出处：

Minfeng Xiao， Xiaoqing Liu， Jingkai Ji， et al. Multiple approaches for massively parallel sequencing of HCoV-19 (SARS-CoV-2) genomes directly from clinical samples. bioRxiv 2020.03.16.993584； doi： https：//doi.org/10.1101/2020.03.16.993584.