ATVB 华中科技大学方超教授团队揭示整合素活化和中性粒细胞募集的新调控机制

中性粒细胞募集到炎症部位需要从血管床内 “渗出Extravasation”，该过程经历四个步骤: “滚动Rolling”、“粘附Adhesion”、“爬行Crawling”和“穿越Transmigration”，分别由选择素Selectins和整合素Integrins等粘附分子介导。整合素巨噬细胞-1抗原(Macrophage-1 antigen, Mac-1)是介导中性粒细胞招募的重要分子，活化的Mac-1与内皮细胞表面的配体如细胞间黏附分子(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等结合，促进中性粒细胞在内皮表面粘附、爬行和迁移。但中性粒细胞整合素活化的调控机制，目前尚不完全清楚。

整合素的活化伴随着胞外段二硫键重排诱导的蛋白构象变化。巯基异构酶是一类催化蛋白质二硫键断裂、形成和异构化的酶，在稳定蛋白构象和调控生物活性等过程中发挥重要作用。内质网蛋白72 (Endoplasmic reticulum protein 72，ERp72)是巯基异构酶家族的重要成员，在中性粒细胞表面高表达，但ERp72是否参与调控Mac-1活化目前尚不清楚。

2024年3月1日，华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系方超教授团队在Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology杂志发表题为“Endoplasmic Reticulum Protein 72 Regulates Integrin Mac-1 Activity to Influence Neutrophil Recruitment”的研究论文，揭示了细胞外 ERp72通过催化二硫键重排调控整合素Mac-1活性从而影响中性粒细胞募集的分子机制，为治疗中性粒细胞相关血管病变提供了新靶点。

研究者采用骨髓移植术构建了髓系ERp72敲除小鼠(BMErp72^-/-)，采用活体荧光显微镜观察中性粒细胞在炎性血管床中的运动情况。结果发现，Erp72^-/-中性粒细胞在炎性微静脉内的黏附/爬行减少，但细胞滚动及速度显著增加。体外静态黏附和微流控动态黏附实验进一步证实，Erp72^-/-中性粒细胞在内皮细胞表面存在黏附缺陷。进一步采用特异性单克隆抗体阻断Mac-1或者LFA-1功能，明确了ERp72敲除导致Mac-1而不是LFA-1的活化缺陷。

接下来，研究人员采用生物素探针Sulfo-NHS-Biotin和Malemide-PEG2-Biotin分别标记膜蛋白和细胞表面游离的巯基，分析ERp72调控Mac-1活性的分子机制。免疫共沉淀结果显示，ERp72与整合素Mac-1在细胞表面存在相互作用，且在中性粒细胞活化的过程中，ERp72能促进Mac-1的CD11b亚基上的活性巯基的暴露。为明确ERp72靶向CD11b的目标二硫键，通过质谱实验发现，ERp72能够切割CD11b“thigh”和“genu”结构域之间的C654-C711二硫键，从而揭示了影响Mac-1活性的一个新的变构二硫键位点。

研究者接着探究ERp72调控Mac-1活性所在的区域。通过共聚焦荧光显微镜发现，中性粒细胞表面ERp72和Mac-1存在共定位，并呈簇状聚合分布；fMLP诱导细胞激活后，脂筏区域Mac-1显著增加，且伴随CD11b活性巯基增加，而ERp72活性巯基显著减少。结果表明，中性粒细胞活化过程中，ERp72在细胞膜脂筏中催化Mac-1的巯基还原。

由于巯基异构酶调控整合素功能可能涉及氧化还原非依赖性的机制(如分子伴侣的作用)，研究者进一步构建了无氧化还原酶活性的ERp72突变体(ERp72-AA，其催化基序CGHC的Cys突变为Ala)。活体荧光成像和体外黏附实验发现，给予野生型ERp72 (ERp72-CC)可拯救Erp72^-/-中性粒细胞的黏附/爬行缺陷。流式细胞术结果显示，ERp72-CC能拯救Erp72^-/-中性粒细胞的Mac-1活化缺陷。以上结果表明，ERp72对Mac-1的调控作用依赖于其氧化还原酶活性。

为进一步证实ERp72对Mac-1的直接活化作用，研究者采用高灵敏的生物膜力学探针技术BFP定量分析Mac-1与其配体蛋白ICAM-1的亲和力。结果显示，野生型ERp72-CC能显著增加Mac-1与ICAM-1的结合亲和力，而催化位点突变后的无活性ERp72-AA则无明显作用。该结果进一步证实，ERp72可通过其催化位点直接活化整合素Mac-1。

最后，研究者采用LPS诱导急性肺损伤模型，研究ERp72调控的中性粒细胞募集在炎症反应中的作用。结果发现，敲除ERp72可显著减少肺泡灌洗液内中性粒细胞的浸润，抑制炎症反应，减轻肺组织损伤，髓系敲除ERp72能提高小鼠的存活率。

综上所述，研究人员发现了调控中性粒细胞募集的新机制和新靶点，揭示了ERp72催化的二硫键重排在整合素Mac-1活性调控中的重要作用。胞外ERp72通过切割CD11b亚基的C654-C711二硫键，诱导Mac-1的构象活化，增加Mac-1的结合力，促进中性粒细胞的黏附和募集。该研究提示胞外ERp72可能是治疗中性粒细胞相关血管炎症的新靶点。

方超教授课题组博士生李尧丰、副教授徐旭林为论文共同第一作者，方超教授为唯一通讯作者。该研究获得了悉尼大学Arnold Ju教授等合作者的大力支持。本研究获得了国家自然科学基金重大研究计划、科技部国家重点研发计划、美国血液学会国际合作项目以及湖北省杰出青年基金等项目的资助。

方超教授课题组长期致力于血栓、止血和血管生物学(Thrombosis, Hemostasis and Vascular Biology)研究，采用荧光活体成像等前沿技术，研究血小板、白细胞以及内皮细胞之间的相互作用，并探索药物的药理学机制。近期的系列研究工作揭示了巯基异构酶在血栓形成及血栓炎性中的作用，为开发安全高效的抗血栓药物提供了新的靶点和多种先导化合物(JACS 2023; Br J Pharmacol 2023; Br J Pharmacol 2021; Pharmacol Res 2021; Pharmacol Res. 2020)，相关研究工作已获得发明专利授权2项。

原文链接：

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.123.319771