Nature子刊：李劲松/汤富酬/吴立刚/徐国良发现DNA甲基化在小鼠原肠胚形成过程中的关键作用

在胚胎发育过程中，DNA甲基化由DNMT3A / 3B建立，随后由DNMT1维持。虽然在这一领域已经进行了大量研究，但DNA甲基化在胚胎发生中的功能意义仍然未知。

2023年5月22日，中国科学院上海生物化学与细胞生物研究所/中国科学院分子细胞科学卓越中心李劲松、吴立刚、徐国良及北京大学汤富酬共同通讯在Nature Communications 发表题为“Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation”的研究论文，该研究通过筛选可以有效引入终止密码子的碱基编辑器，建立了受精卵中多个内源基因同时失活的系统。具有Dnmts或Tets突变的胚胎可以用IMGZ一步生成。Dnmt-null胚胎在E7.5处显示原肠胚形成失败。有趣的是，虽然DNA甲基化不存在，但原肠胚形成相关的途径在Dnmt-null胚胎中被下调。

DNMT1，DNMT3A和DNMT3B对原肠胚形成至关重要，并且它们的功能与TET蛋白无关。在某些启动子上，DNMT1或DNMT3A/3B可以维持高甲基化，这与miRNA的抑制有关。引入六个miRNA的单个突变等位基因和父系IG-DMR部分恢复了Dnmt-null胚胎中的原始条纹伸长。因此，该研究揭示了启动子甲基化与抑制miRNA表达之间的表观遗传相关性，并证明IMGZ可以加速破译体内多个基因的功能。

DNA甲基化在小鼠植入前和植入后发育过程中被动态擦除并重新建立。受精后，配子发生过程中建立的精子和卵母细胞中全局5mC通过TET介导的主动去甲基化和DNA复制介导的被动去甲基化在所得胚胎中逐渐被擦除，在囊胚期达到低点。值得注意的是，DNMT蛋白的从头DNA甲基化也发生在全基因组去甲基化过程中，并且在受精卵中受到TET介导的DNA去甲基化的影响。随后，发生由DNMT3A和DNMT3B介导的从头甲基化，发育中的胚胎在原肠胚形成过程中恢复DNA甲基化水平，然后通过DNMT1的细胞分裂保存并确定谱系规范。

携带DNMT1或DNMT3A/3B突变体的小鼠胚胎已经产生并在妊娠中期显示出胚胎致死性，证明了它们在早期胚胎发育中的重要作用。然而，尽管已经产生了缺乏DNA甲基化的Dnmt-nullESC和滋养干细胞，并显示出正常的自我更新能力，Dnmt-null胚胎尚未实现，主要是由于使用种系特异性条件敲除亲本建立复杂育种系统的困难。因此，DNA甲基化在小鼠胚胎发生中的发育功能仍有待确定。

最近，通过将Cas9切口酶与胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂相结合，建立了CRISPR-Cas9介导的碱基编辑（BE），通过C>T或G>A碱基替换在特定位点进行基因组重写。与传统的CRISPR-Cas9介导的基因组编辑相比，BEs引起的突变更加精确可控。同时，BE系统通过在培养细胞中引入过早终止密码子（分别为CAA，CAG，CGA，TGG）来沉默基因的理想工具。此外，BEs可以通过直接注射到受精卵中来破坏所得小鼠中的靶基因。

受精卵注射BE3可用于生产三基因敲除小鼠。因此，可以使用BE3通过同时灭活Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b来研究DNA甲基化的发育功能。然而，每个基因的两个sgRNA已被用于他们的系统中，导致所得胚胎中的基因型复杂。同时，由于过去几年已经开发了几种不同的BE系统，有必要通过比较研究一步揭示生产具有多个敲除基因的胚胎的最有效方法。

筛选高效的碱基编辑器并分析其脱靶效应（图源自Nature Communications）

该研究从六个可用系统中筛选出最有效的胞嘧啶碱基编辑器，并确定hA3A-eBE3-Y130F可以通过受精卵注射有效地在目标位点引入终止密码子。接下来，该研究建立了基于hA3A-eBE3-Y130F的IMGZ（受精卵中多个基因的失活）系统，以有效地产生Tet和Dnmt家族基因之间具有多个突变基因的胚胎。通过这些突变胚胎，该研究发现Dnmt家族基因通过调节miRNA的剂量在胚胎原肠发育中发挥关键作用，而这些作用不依赖于TET蛋白。总之，该研究结果提供了体内证据，支持DNA甲基化介导的精确的整体miRNA剂量也参与了基因表达的微调，这可能涉及调节原肠形成和胚层的规范。

参考消息：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-38528-z