Nature：Editas再次突破基因编辑的“脱靶效应”，向临床应用迈进一大步！

J. Keith Joung（图片来源：Editas Medicine官网）

在CRISPR系列的基因编辑系统中，Cas9酶是一个非常关键的组成部分，但是CRISPR/Cas9的脱靶效应是一直急需攻克的难题，它严重制约了基因编辑系统的实际临床应用的可能。因为脱靶效应，使得基因编辑的特异性可能不高，会产生异想不到的“副作用”，脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。攻克脱靶效应，是科研人员一直追求的梦想。在上个月Editas另一位创始人张锋也采用了一种新技术解决脱靶问题，见报道：Science：基因编辑脱靶效应被张锋攻克，有望应用于临床精准基因修复 

有关脱靶效应，在2013年张锋团队就意识到这一重大的问题，并提出初步解决方案：Nat Biotech：新方法可消除CRISPR-Cas的脱靶效应，实现完美基因编辑，在2015年成功地实现把脱靶效应控制在不可检测的范围。相信，接下来还会进一步提高，希望形成更精准的基因编辑系统。

1月6日，发表在Nature杂志的一项研究中，麻省总医院（MGH）的研究人员J Keith Joung开发出一个新版本的Cas9酶或将强有力的解决这一困扰CRISPR/Cas9系统的障碍，使脱靶效应降低到无法检测的水平。该成果阐述了经改版的Cas9酶是如何降低与靶DNA（target DNA）的非特异性作用，这将大大扩大基因编辑技术的应用可能性。J Keith Joung也是Editas创始人之一。

新版本的Cas9酶是如何形成的？

MGH团队的研究一直基于这样一个事实，即Cas9酶自身的某些部分可以与靶DNA分子的骨架（backbone）相互作用。J Keith Joung博士称，研究小组一直在针对CRISPR/Cas9系统的脱靶效应进行研究。他们猜测，降低Cas9酶与靶DNA的之间的互相作用或许可以更加完全的消除脱靶效应，且保留所需的靶向互作（on-target interaction）。

基于参与该研究的Vikram Pattanayak博士的前期研究成果，研究小组将能够绑定DNA骨架的长氨基酸侧链替换成了较短的、使绑定不能进行的短链，改变了Cas9酶介导的4个连接（Cas9-mediated contact）。

随后，研究人员检测了15种Cas9酶可能的变异体（通过任意改变1条链、2条链、3条链、4条链），最终发现了一个替换3条链和一个替换了4条链的变异体 显示出巨大的潜能，在人类细胞中既能够区别出错误的靶点，还可以保留完整的正确靶向活性。研究小组进一步对替换了4条链的变异体进行了充分表征，他们将其称之为SpCas9-HF1（SP代表酿脓链球菌，是广泛使用的野生型cas9的来源，HF代表高保真度）。

改版后的CRISPR/Cas9系统效果如何？

与野生型SpCas9相比，这一突变体在他们检测的37种不同的导向RNAs中，与其中超过85%的导向RNAs形成了靶向效应（on- target effect）。通过Joung实验室2014年开发的检测CRISPR/Cas9脱靶效应的高敏感系统GUIDE-Seq，研究小组发现，野生型 SpCas9与7种导向RNAs结合引发了25个脱靶突变，而使用SpCas9-HF1与其中6种导向RNAs结合并未产生可检测到的脱靶效应，与第7种 导向RNAs结合形成了1个脱靶位点。

研究小组还发现，当靶向非典型DNA位点（有1个或2个核苷酸重复序列， 通常会产生许多脱靶突变）时，SpCas9-HF1也能够降低脱靶效应。科学家们还开发出了SpCas9-HF1的系列衍生物，包括HF2、HF3 和 HF4。这些衍生物能够消除HF1变异体和少数导向RNAs结合时剩余未解决的脱靶效应。

Joung系Editas Medicine的创始人之一

据 xconomy网站报道，Joung其实是已经在纳斯达克挂牌上市申请的基因编辑公司Editas Medicine的创始人之一。他说：“这项研究成果中的变异体可以很容易地替代野生型SpCas9，为脱靶突变降低至无法检测到的水平提供了一种高效的 方法，可被目前使用CRISPR/Cas9技术的所有人广泛地使用。”同时，他也强调，证明这一研究能都使CRISPR/Cas9变得足够精准、足够安全还需要更多的工作。他说：“我非常看 好CRISPR-Cas9疗法的前景。然而，如果基于CRISPR的治疗需要将数以百万的CRISPR/Cas9拷贝放入人体细胞中，那么目前的精准度还 不够好。对我来说，现在的挑战是如何开发更加敏感的方法。”

另一创始人张锋的同类研究成果

脱靶效应是基因编辑领域主要的一个障碍，尤其是对于那些希望将该技术应用到人类疾病治疗中的科学家和管理者。Editas Medicine另一创始人张锋曾于去年11月30日的《科学》上发表了同类研究成果，有效改善了该系统的脱靶效应（Science：基因编辑脱靶效应被张锋攻克，有望应用于临床精准基因修复）。

张锋的团队通过改变构成化脓性链球菌Cas9酶的约1，400个氨基酸中的3个氨基酸将“脱靶编辑”显著减少至无法检测到的水平。研究人员利用了Cas9蛋 白的结构知识来降低脱靶切割（off-target cutting），即带负电荷的DNA是结合到带正电荷的Cas9蛋白的凹槽。基于这样的原理，他们预测，相较于“靶向”序列，用一些中性氨基酸来替代正 电荷的氨基酸，可以减少Cas9与“脱靶”序列的结合。

从论文发表来看，张锋与Joung虽然同在一个公司，但是分属不同团队，完全独立进行攻克基因脱靶等难关，而且几乎是同时取得突破性进展。

Editas Medicine是基因编辑领域在临床实验上进展较快的公司。去年11月，Editas的CEO Katrine Bosley 表示，公司计划在明年开启CRISPR治疗一种先天性黑朦症失明的临床试验，这个疾病是一种单基因疾病，非常合适基因编辑进行。如果计划顺利，那么这项研究将是CRISPR编辑人类DNA的首例。详细见：两年内基因编辑将应用于眼科先天性黑朦治疗

原始出处：

Benjamin P. Kleinstiver,Vikram Pattanayak,Michelle S. Prew,Shengdar Q. Tsai, Nhu T. Nguyen,Zongli Zheng & J. Keith Joung.High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.Nature (2016) doi:10.1038/nature16526

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