单细胞测序应用及技术实例
2017-03-07 MedSci MedSci原创
作为“在单个细胞水平上对基因组进行测序”的单细胞测序技术能够解决上述难题。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。与此同时，测序巨头相继推出新一代测序仪，为单细胞测序提供利器，越来越多与单细胞测序有关的研究也发表在顶级期刊上，这些都表明，单细胞测序已逐渐成为科研热点。单细胞测序应用及技术实例单
作为“在单个细胞水平上对基因组进行测序”的单细胞测序技术能够解决上述难题。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。与此同时，测序巨头相继推出新一代测序仪，为单细胞测序提供利器，越来越多与单细胞测序有关的研究也发表在顶级期刊上，这些都表明，单细胞测序已逐渐成为科研热点。本文小编就单细胞测序应用及技术实例进行了梳理，与大家一起学习进步。
单细胞测序应用及技术实例
PNAS杂志在线发表了北京大学生命科学学院生物动态光学成像中心谢晓亮、白凡课题组与北大肿瘤医院王洁团队合作的研究结果。他们通过单细胞基因测序手段首次报道了对于癌症病人单个外周血循环肿瘤细胞的全基因组、外显子组测序结果，此项研究对于揭示癌症转移的分子机制具有重要意义，同时还为无创癌症诊断提供了一种新的技术手段。肿瘤的转移是导致癌症病人死亡的主要原因。
研究过程中研究人员意外地发现来自同一个病人的不同 CTC 都展现出高度一致的全基因组拷贝数变化模式，和同一病人的转移位肿瘤组织的拷贝数变化模式一致。这种现象在肺腺癌和小细胞肺癌的病人中都得到了验证。此外，在不同的肺腺癌病人中， CTC 展现的全基因组拷贝数变化模式具有高度的相似性。肿瘤的异质性长期以来被当作是恶性肿瘤的重要特征。 首次在 CTC 中观察到的高度一致的拷贝数变异模式将会改变传统上对肿瘤异质性的理解，揭示了特定的拷贝数变异在肿瘤形成及转移中发挥了重要的作用。
进一步研究发现，小细胞肺癌患者的拷贝数变异模式与那些肺腺癌患者明显不同，展现出癌种之间一定的特异性。这种特异性可能跟肿瘤发展、转移所处的微环境相关。这项发现为将来基于 CTC 拷贝数变异来进行癌症病人分型提供了理论基础。
国际著名杂志Cell在线刊登了武汉大学生命科学学院研究人员的最新研究成果“Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm，”，文章中，研究者研发出了一种解析单细胞基因组的新方法，该研究同时登上了当期Cell研究的新亮点。
该文章的并列第一作者宋卢挺，系首批加入武汉大学——华大基因联合培养创新班的七名同学之一，于2010年3月赴深圳华大基因研究院从事基因组学研究工作。联合培养期间，宋卢挺充分利用华大基因研究院作为全球最大基因组学研究中心的平台优势，积极把握各种学习和锻炼的机会，在2010年的第五届国际基因组大会（ICG-V）上作主题报告，最终成长为华大基因研究院癌症单细胞研究的负责人。
在本项研究中，以宋卢挺为项目负责人的研究团队研发了一种解析单细胞基因组的新方法，并将该方法应用于原发性血小板增多症（ET）的肿瘤内部遗传特征研究，在肿瘤研究上获得突破性进展。
此单细胞测序新方法是遗传异质性肿瘤的高精度、全面评估的一个非常优秀的研究工具，为从单核苷酸水平深入研究癌症发生、发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路。这种新方法和产生的数据为鉴定与肿瘤发展相关的候选基因提供了科学依据，也必将会推动癌症的遗传机理和生物学过程更深入的研究。此外，这一新方法还可被广泛用于其他重要的生物研究领域，如组织器官内细胞基因组的异质性研究、干细胞的异质性研究、生殖细胞的遗传重组研究、胚胎的植入前遗传学诊断研究等
多重退火和成环循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC）
由哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓亮（Sunney Xie）教授研发的多重退火和成环循环扩增技术，降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。技术论文：Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell
技术简介：PCR扩增具有偏好型而且基因组具有大量的冗余，造成了基因组测序准确性不高。谢晓亮研发的MALBAC技术能从一个细胞的基因组中，分离出来自单细胞的DNA，然后添加称作引物的短DNA分子。这些引物可与DNA的随意部分互补，从而使得它们能够附着到DNA链上，充当DNA复制起点。
这些引物由两个部分构成——一个包含8个核苷酸的粘性部分变化多样，可与DNA结合，再加上一个包含27个核苷酸的共同序列。这一共同序列可防止DNA太 多次拷贝，大大地降低了扩增偏倚。通过将自身掺入到新拷贝链，从而自身成环，防止了过度拷贝。利用这种方法，进行与加入的引物的DNA复制时，可以完成高 达93%的基因组测序。
基于芯片实验室技术的单细胞测序
由斯坦福大学Stephen Quake研发的基于芯片实验室技术的单细胞测序，是基于lab on a chip开发，本技术设计了一种路线，用液体载运细胞通过一连串显微管道和微阀门，当细胞挨个进入各自的小空位时，它们的DNA就会被提取出来，经过复制用于进一步分析。
此外，本技术不仅能分离细胞，还能用化学试剂将细胞混合起来，通过检测反应过程中的荧光发射获得它们的基因编码。所有这些都能在芯片上完成，不仅操作简单，而且成本效益高。
Stephen Quake已利用此技术完成了第一例人类单细胞测序，现在他正利用这项技术研究精子细胞中的重组并分析突变率。技术论文：Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm
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