Nat Commun：突触可塑性调节的新机制

突触功能是学习和记忆的基础，其功能增强主要通过长时程增强(LTP)，减弱则通过长时程抑制(LTD) 。

突触的长时程抑制(LTD)可以有多种形式，并有助于环路重建、记忆编码或擦除。LTD涵盖各种诱导途径，包括NMDA、mGlu或P2X受体的激活。

在CA1锥体神经元突触的Schaeffer侧枝上，这些LTD类型依赖的突触可塑性通常受到AMPA型谷氨酸受体数量和AMPAR的自由扩散和锚定在PSD上形成的膜平衡的调节。这种平衡涉及AMPAR相关蛋白和突触后支架蛋白（例如PSD-95）的结合。然而，目前研究很少涉及LTD引起的分子重组。

在此背景下，来自法国波尔多的神经科学研究所的研究人员于2021年5月14号在Nature Communications上发文，NMDAR依赖性LTD触发PSD-95的深刻重组，导致突触后膜变化，增加短期可塑性，从而改善抑制性突触的神经元反应。

1.ATP和NMDA处理均可诱导突触AMPAR含量和微型振幅的长期下调

作者通过直接随机光学重建显微镜(dSTORM)实验和电生理记录大鼠原代海马神经元的ATP或NMDA处理后的AMPAR组织和电流，从膜表面的孤立受体中提取单个AMPAR的荧光发射特性，并用于估计不同神经元区室AMPAR的密度和数量。

NMDA处理后会导致树突轴和棘中AMPAR密度快速稳定降低。NMDAR依赖性LTD还与每个纳米域AMPAR含量的快速（在NMDA应用后的前10分钟内）和稳定（最多3小时）消耗有关。

AMPAR突触的这种重组与AMPAR介导的微小兴奋性突触后电流（mEPSC)的抑制有关，在NMDA处理后可以持续长达3小时。ATP处理AMPAR纳米级组织后能够诱导强大且持久的LTD，这种AMPAR纳米域的消耗与mEPSC振幅的稳定持久下降有关。

图1 NMDA和ATP应用在与长期突触电流抑制相关的突触处触发AMPAR快速持久的纳米级重组

2.AMPAR横向扩散在NMDAR依赖性LTD期间增加，但在P2XR依赖性LTD期间不增加

突触可塑性与AMPARs胞吞和胞吐作用都有关。AMPAR通过横向扩散从突触逃逸后，被突触前膜短暂内吞，从而诱导了NMDAR和P2XR 依赖性的LTD。

基于此，作者通过单粒子跟踪技术uPAINT，测量了细胞表面的内源性AMPAR亚基GluA2的迁移率，以及通过树突表达eGFP-Homer1c作为突触标记物。在基础条件下和NMDAR或P2XR依赖性LTD诱导下在对细胞进行样本采集。

NMDA处理后，AMPAR移动部分增加了35%。然而载体（H2O）处理或ATP处理后AMPAR横向扩散没有变化。NMDAR依赖性LTD诱导后AMPAR迁移率的增加在NMDA处理后的前20分钟内逐渐发生并保持稳定长达3小时。

当LTD由NMDA处理诱导时，移动受体的固定持续时间（反映AMPAR对支架蛋白的亲和力）显著降低。在应用NMDA之前，在突触处，含有GluA2的受体在轨迹持续时间的约60% (60.56 ±1.91) 中保持不动，而该持续时间在10分钟后降至48.92% ±2.11，并在NMDA治疗后30分钟降至40.37% ± 2.03。相比之下，在ATP处理后，该百分比保持不变。

该部分结果显示，受抑制的突触的长期平衡可能不是通过内/胞吐不平衡来维持，而是通过改变AMPAR与PSD相互作用来维持，以牺牲固定受体为代价来增加移动受体池。

图2 NMDAR依赖的LTD而不是P2XR依赖的LTD触发了AMPAR横向扩散的长期增加

3.NMDAR依赖性LTD 使PSD-95 T19位点磷酸化，并通过自噬诱导其降解

PSD-95是兴奋性突触后密集区的主要支架蛋白，也是突触AMPAR稳定的主要参与者。PSD-95的T19残基是一个GSK3β磷酸化位点，对LTD的诱导至关重要，且PSD-95在LTD期间的降解可能是由自噬诱导的。

WT PSD-95的过度表达触发了每个纳米域突触AMPAR和PSD-95分子的增加，与mEPSC振幅的增加相关。WT PSD-95 在NMDAR依赖性LTD诱导时导致突触AMPAR和PSD-95的数量减少，且mEPSC振幅减少。

相比之下，T19A突变体PSD-95的过表达阻止了NMDA诱导的突触AMPAR和PSD-95数量的减少，并抑制了mEPSC的抑制。进一步应用TDZD8（GSK3β抑制剂），发现前10分钟内，NMDA治疗引发了突触强度（mEPSC）的下降。然而，在诱导后20和30分钟，突触抑制被消除。

这些结果证明特异性NMDAR而非P2XR依赖性LTD，在PSD-95的T19位置触发磷酸化，将PSD-95蛋白靶向自噬体，使PSD-95蛋白降解，且这种抑制负责维持LTD并导致AMPAR表面迁移率的增加。

图3 T19位置的PSD-95磷酸化对于NMDAR依赖的LTD诱导的分子重组至关重要

4.在NMDAR依赖的LTD期间短期可塑性增加，需要AMPAR横向扩散

为了确定NMDAR与P2XR抑制的突触中移动AMPAR比例差异是否对突触产生功能性影响。作者对急性海马脑切片中的CA1神经元进行了全细胞膜片钳记录，并在刺激Schaffer侧枝时测量了短期突触可塑性。

应用NMDA后，EPSC振幅降低了约35%，ATP诱发EPSC振幅降低了约28%。表达P2XR依赖性LTD的神经元不会触发AMPAR迁移率的增加，呈现出与基础状态期间测量的相似的配对脉冲响应。相比之下，用NMDA处理的神经元，表现出移动AMPAR比例的增加，与基础状态的神经元相比，配对脉冲比显著增加。

在培养的神经元中表达了荧光谷氨酸报告基因（iGluSnFR），并测量了通过电场刺激触发突触前动作电位后突触后荧光的变化。LTD方案（ATP或NMDA）均未显着改变突触前释放概率。

在1Hz刺激15分钟后，观察到第一个峰值幅度下降23±5.1%。LFS（低频刺激）诱导LTD后30分钟，与诱导前相比，神经元的配对脉冲比显著增加，证实了突触诱导的LTD引发与NMDAR依赖的LTD相似的反应。

图4  NMDAR依赖性LTD与频率刺激促进相关，而不影响释放概率

5.建模证实增加 AMPAR的移动性可以改善突触反应

为了从理论上评估AMPA内吞作用或解除捕获对AMPAR移动性、组织和突触反应的影响，我们使用MCell软件进行了蒙特卡罗模拟。

根据文献和实验结果，模拟AMPAR电流幅度与两个不同相互作用常数变化之间的关系：（1）内吞速率（k8*3），（2）PSD-95失活率 (k6*4)。

k6*4Inact条件触发了配对脉冲比的增加，第二次释放的AMPAR激活增加了18.7%，第三次释放增加了20.4%。而 k8*3Endo条件不影响AMPAR移动性，并没有改变频率的突触响应。这些模拟表明，由于陷阱数量减少引起的自由扩散 AMPAR 池的增加足以触发配对脉冲促进。

图5 计算机模拟图，AMPAR 解脱诱导了突触电流的抑制和突触反应性的增加

结 论

综上，NMDAR或P2XR依赖性LTD都与突触AMPAR的丢失和重组有关，但只有依赖NMDAR的LTD诱导才能触发PSD-95的深刻重组，其分子机制是PSD-95的T19位置触发磷酸化，将PSD-95蛋白靶向自噬体，使PSD-95蛋白降解进而导致AMPAR表面迁移率增加。突触后变化通常发生在NMDAR依赖性LTD期间，导致短期可塑性增加，从而改善了抑制性突触的神经元反应。