Cell：泛癌多组学分析揭示转移性肿瘤中微生物组多样性与免疫治疗反应关系

微生物群落与人体有着密不可分的联系，其在人体的多个生态位繁衍生息，同时也是宿主免疫系统和抗癌疗法应答的重要调节剂。微生物有助于免疫系统的发育，可维持粘膜屏障的完整性，已有研究揭示微生物组的组成、功能与癌症发生和治疗反应存在关系。特别地，肠道微生物组具有最大的微生物种类多样性，能够调节对免疫检查点阻断检查（ICB）和传统化疗的应答，并与肿瘤新抗原的分子拟态相关。

原发肿瘤中的微生物群已被证明与非恶性组织中的微生物群不同，可驻留在细胞内，能够对肿瘤微环境（TME）进行重编程。目前，肿瘤转移是90%实体癌患者死亡的主要原因，也是系统性抗癌治疗的关键靶点，但肿瘤转移中微生物组的生物学和临床相关性尚不清楚，因此迫切需要了解肿瘤驻留微生物如何重塑肿瘤生物学、免疫浸润和对治疗的反应。

荷兰癌症研究所的科研人员在Cell发表了题为“A pan-cancer analysis of the microbiome in metastatic cancer”的文章。研究团队通过整合来自26种组织的4,160例转移性肿瘤活检样本中宏基因组学、基因组学、转录组学和临床数据，分析了微生物组在肿瘤转移中的存在及其相关性，确定了微生物的器官特异性趋向性（tropism）、缺氧肿瘤中厌氧细菌的富集、微生物多样性与肿瘤浸润中性粒细胞之间的关联，以及梭杆菌与ICB耐药性之间的关联。此外，纵向肿瘤取样揭示了微生物群落的时间演变，并确定了ICB后耗竭的细菌。总之，该研究构建了转移性肿瘤微生物组的泛癌资源，有望开发新的治疗策略。

文章发表在Cell

01 挖掘肿瘤转移中的微生物组信息

在一系列转移性癌症类型中，研究团队首先使用两种独立的计算方法（Kraken2和PathSeq）提取了未映射reads，在属种水平上表征了肿瘤驻留微生物群落的特征；并进一步通过宏基因组分析方法，进行物种水平的基因组组装。研究团队分析了4,164份经全基因组测序（WGS）的治疗前肿瘤活检样本，共涵盖26种癌症类型，对其进行过滤筛选。结果显示，共分类出165个菌属，其中49%为革兰氏阴性菌，68%为厌氧/兼性厌氧菌；从肿瘤细菌reads中组装出514个接近高/中等质量的宏基因组（MAGs）。最常见的癌症类型是乳腺癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌和黑色素瘤，肝脏、淋巴结和肺部是最常见的肿瘤活检转移部位。

分析显示，不同癌症类型中，细菌来源reads数量与人类映射reads数量的比例（Fractional reads）存在差异，在子宫癌和肾癌中的比例较高，而原发性中枢神经系统（CNS）癌症中的比例较低，在部分结直肠癌和肾转移癌中的比例也较高。生物多样性指标显示，多种癌症类型的微生物群落在总体上是丰富且平衡的，但CNS癌症中的微生物群落的丰富度较低。此外，结直肠癌转移癌中微生物多样性最丰富，而头颈部转移癌具有更多的优势属种。

图1. 4160个转移性癌症样本的肿瘤微生物组的计算分析。

02 塑造转移性肿瘤微生物组

研究团队试图确定影响转移性肿瘤微生物组组成的因素，发现与原发肿瘤组织相比，活检病变解剖的部位对微生物群落组成的影响更大（图2）。为评估癌症类型特异性微生物种群，研究团队计算了所有癌症类型微生物群落的相似性，并确定了群落水平的差异。与其他癌症类型相比，原发性CNS癌症、间皮细胞癌症和头颈部癌症的微生物组成差异较大；结直肠活检组织的转移定位之间偏差最大。

在一组具有匹配RNA测序（RNA-seq）数据的转移性肿瘤中，研究团队使用缺氧基因标记测量了缺氧程度，并进行基因集富集分析（GSEA）。结果显示，肿瘤的低氧环境与厌氧菌的丰富度具有显著相关性。厌氧细菌在缺氧时显著正富集，氧充足时显著负富集，需氧细菌则与此相反。此外，独立验证数据证实，缺氧程度较高的肿瘤中厌氧菌富集；具有较高厌氧菌多样性的肿瘤在低氧基因集的表达上也更为活跃。

此外，研究团队还对微卫星不稳定（MSI）或稳定（MSS）肿瘤的泛癌症组进行了检测分析，发现可依据MSI状态将两个离散的聚类显著分离。这表明在泛癌症环境中，不同的肿瘤表型与微生物群落结构之间存在潜在关联。

图2. 转移性癌症肿瘤微生物组的特征。

03 驻留微生物群落与肿瘤生物学相关

研究团队分析了微生物群落能否影响宿主免疫进而影响TME，发现肿瘤微生物组组成与几个MSigDB标志性特征和免疫标志物基因表达变异之间存在显著对应关系。接下来，研究团队将细菌多样性与肿瘤特异性反应途径的表达相关联，以确定随细菌多样性增加而被激活或抑制的途径（图3）。结果显示，在细菌多样性较高的肿瘤中，参与细胞外基质（ECM）组织和抗菌肽（AMP）的多种途径显著富集。上述结果表明，微生物群落可通过影响炎症反应途径，可能参与调控肿瘤生物学行为和肿瘤微环境的动态平衡。

研究团队将肿瘤免疫逃避机制与细菌多样性相联系，发现细菌多样性与癌症相关成纤维细胞（CAF）浸润和免疫排斥特征的表达呈正相关。进一步，研究团队检查了去卷积肿瘤浸润免疫细胞组成。在细菌多样性较高的肿瘤中，由中性粒细胞、自然杀伤细胞（NK）和巨噬细胞以及调节性T细胞（Treg）驱动的先天免疫细胞广泛富集（图3E），这凸显了微生物群落在肿瘤免疫调节中的潜在作用。

通过将细菌丰度与免疫细胞功能状态相关联，研究团队试图确定单个细菌-免疫细胞的关联。结果显示，多种细菌与成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和CD4 T细胞的细胞状态相关，如双歧杆菌与NK细胞呈正相关。这些数据揭示了微生物组和免疫系统之间存在强关联，同时也提供了转移性肿瘤中宿主-微生物相互作用的更深层次理解。

图3. 微生物组与肿瘤生理学的关系。

04 转移瘤中微生物群随时间和治疗介入的变化

为了解转移异质性的影响以及肿瘤驻留微生物随时间的变化，研究团队分析了185对活检样本（来自173名患者），样本的活检间隔中位时间为7.5个月（图4）。定量分析显示，细菌丰度在配对活检样本之间具有良好的相关性。通过调查来自相同或随机肿瘤对之间的微生物群落相似性，研究团队观察到来自相同病变肿瘤对的相似性显著更高。此外，研究团队还分析了肿瘤微生物组的菌株水平多样性，发现与随机配对活检样本相比，配对活检样本的共享相似性程度显著增加。

接下来，研究团队比较了肿瘤暴露于免疫疗法、靶向治疗或激素治疗之前（第一次活检）和之后（第二次活检）细菌丰富度的变化，以探究治疗压力对细菌群落的影响（图4C）。结果显示，在仅接受ICB治疗的患者中出现细菌丰富度显著降低；经具有已知抗生素作用模式的化疗药物（如阿霉素/表阿霉素和博莱霉素）治疗后，细菌丰度也呈降低趋势。

在一小部分患者中，与无应答患者相比，免疫应答患者的细菌丰富度显著降低。此外，在应答患者接受ICB后，放线菌、类杆菌、双歧杆菌和普雷沃特氏菌等几种细菌经常被反复耗尽。综上，免疫治疗对转移性肿瘤微生物组的影响可重塑群落结构，并在应答患者中更为明显。

图4. 肿瘤微生物组在全身抗癌治疗过程中的动力学。

05 梭杆菌与非小细胞肺癌中对ICB的不佳应答有关

最后，研究团队检测了与ICB治疗反应不佳相关的微生物群，并对非小细胞肺癌（NSCLC）队列患者进行无偏倚的ICB单药治疗分析（图5）。结果显示，梭杆菌的丰度与持久临床获益（DCB）存在显著负相关。多变量Cox比例风险模型显示，总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的降低与梭杆菌的持续高丰度显著相关。此外，在梭杆菌丰度较高肿瘤中，细胞毒性、IFNG和主要组织相容性复合体（MHC）II类基因表达特征显著较低。

图5. NSCLC中梭杆菌的存在与ICB应答呈负相关。

综上所述，该研究整合了宏基因组学、基因组学和转录组学，探究了微生物在转移性癌症中的作用，并揭示了肿瘤驻留微生物组的组成与癌症的缺氧和炎症等特征相关，并可能影响免疫细胞浸润和免疫疗法的疗效。研究团队全面分析了转移性肿瘤微生物组，同时解析了肿瘤及其TME的生理特征，可提供大量创新的生物学见解并有望指导以细菌为导向的治疗策略开发，以补充和增强癌症免疫治疗效果。

论文原文：

Thomas W. Battaglia, Iris L. Mimpen, Joleen J.H. Traets, et al. A pan-cancer analysis of the microbiome in metastatic cancer. Cell. 2024. DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.03.021