【论肿道麻】Nature Cancer:肿瘤转移时昼夜节律对肿瘤干细胞及肿瘤微环境的调控作用

生物钟是指约每24h体内经历的一次生物周期。内部生物钟的扰动及其与外部生物钟的错位称为昼夜节律紊乱，国际癌症研究机构将昼夜节律紊乱列为潜在的致癌原因。2024年4月《Nature Cancer》杂志上发表一篇名为《Circadian regulation of cancer stem cells and the tumor microenvironment during metastasis》的论著。作者阐述肿瘤细胞受到昼夜节律控制，昼夜节律可增强肿瘤干细胞（CSC）与肿瘤微环境（TME）之间的交互，并探讨昼夜节律对肿瘤远处转移的影响，时间疗法在靶向CSCs和时钟基因方面的潜在应用，以及如何增强时间疗法的效果并促进其临床转化。

生物钟是指约每24h体内经历的一次生物周期。它与地球的明-暗周期保持一致，能根据日间生理变化感知并调节机体，哺乳动物有一套级联结构调控生物钟，包括下丘脑视上核（SCN）、大脑中枢以及外周器官（如胃肠道及心血管系统）。SCN中存在光反应神经元，通常与24h亮-暗周期保持一致，并通过神经释放及激素分泌与外周生物钟器官协同工作。为维持自身生物节律，外周器官也对多种环境刺激作出相应反应，并反馈调节中枢生物钟（图1a）。内部生物钟的扰动及其与外部生物钟的错位称为昼夜节律紊乱，可由睡眠不足和/或剥夺、旅行时差或社交时差引起的。根据以上发现，国际癌症研究机构将昼夜节律紊乱列为潜在的致癌原因。尽管多项临床前研究表明，昼夜节律紊乱也在促进癌症转移方面发挥作用，但其潜在机制仍不清楚。

图1a.哺乳动物的核心昼夜节律计时系统

肿瘤转移是大多数癌症相关死亡的原因，并在很大程度上受到复杂且动态变化的肿瘤微环境（TME）的影响，肿瘤在TME中发展、侵袭并播散到远端器官。TME影响肿瘤与宿主组织的相互作用和交流，从而调节免疫反应、血管生成和上皮-间质转化（EMT），以促进肿瘤的发展和扩散。值得注意的是，研究认为TME有助于建立和调节肿瘤干细胞（CSC），增强CSC抗药性并促进远处转移。TME保护CSC免受免疫监测，增强其侵袭能力，甚至促进非干细胞性肿瘤细胞的去分化，以补充CSC池。CSC池的大小及其局部TME日常可出现较大波动，表明肿瘤细胞受到昼夜节律控制。昼夜节律可增强CSC与TME之间的交互，因此对昼夜节律的探究或可提供消减CSC、减少肿瘤远处转移及复发的崭新治疗手段。在本综述中，作者主要探讨昼夜节律对肿瘤远处转移的影响。作者探讨了时间疗法在靶向CSCs和时钟基因方面的潜在应用，以及如何增强时间疗法的效果并促进其临床转化。

分子生物钟

分子生物钟的核心在于转录-翻译反馈机制。在白天时段，BMAL1和CLOCK转录因子形成异二聚体，结合并激活时钟控制基因（包括转录抑制因子PER1–PER3、CRY1和CRY2）的节律性表达。在夜间时段，PER和CRY蛋白易位到细胞核，抑制编码CLOCK–BMAL1异二聚体的基因的转录。在CK1δ、CK1ε和AMPK激酶的辅助下，PER和CRY蛋白被特定的E3连接酶复合物逐渐磷酸化和降解。上述蛋白的降解可恢复CLOCK–BMAL1异二聚体的转录功能，并在第二日早上启动下一个周期。这个反馈回路通常需要24h。在第二个反馈回路中，CLOCK–BMAL1异二聚体调节核受体RORs和REV-ERB（REV-ERBα和REV-ERBβ）的表达，反过来又可分别激活或抑制BMAL1。在第三个反馈回路中，DBP和转录抑制因子NFIL3直接与RORA/B基因的D-box结合，以促进其表达（图1b）。

图1b.哺乳动物的核心昼夜节律计时系统

小鼠生物钟紊乱模型

因所使用的小鼠和干扰手段不同，强制扰乱生物钟后的表型也各有差异，难以保持一致。小鼠生物钟紊乱模型的具体造模方法可见表1。简而言之，干扰生物钟主要有改变外部环境或基因两种方法。环境干扰大多通过慢时差（CJL），它可调整明暗周期从而扰乱标准的觉醒-睡眠周期，此模型模拟现代生活中多数昼夜节律失调的情况，因此研究者们认为此种建模方法更具临床相关性。而生物钟基因突变动物模型需要24h以上的实验调研，因为生物钟相关基因还具有其它的生物功能。虽然突变小鼠模型并不能完全模拟生理情况，但它们的确存在昼夜节律紊乱，是宝贵的研究工具。CJL及模式小鼠被广泛应用于昼夜节律紊乱对肿瘤转移影响的研究中(表1)，将携带改变昼夜节律或其他相关基因修饰的肿瘤细胞移植到响应CJL的小鼠体内，由此对肿瘤转移过程和机制进行了详细的阐明与探究。此外，食物和运动是调控外周生物钟的重要因素，改变食物成分可以代谢重新编程中枢和外周生物钟。因此，高脂肪食物干扰细胞间相互作用，导致肿瘤生长，而运动则通过诱导器官的高营养需求来预防癌症转移。肿瘤组织还是重要的内源性昼夜节律重组器，通过释放TME内的肿瘤代谢产物、炎性细胞因子和其他成分，调控肝脏等其他脏器的生物节律，促进肿瘤转移，然而这对中枢生物钟没有影响。值得注意的是，肿瘤及其TME中生物节律相关基因表达存在差异，提示在肿瘤生成及转移过程中对生物节律的调控机制十分复杂。

表1.癌症研究中使用小鼠模型来研究昼夜节律紊乱

生物钟调节肿瘤转移过程中的CSCs和TME

CSCs处于肿瘤细胞结构的顶端，具有自我更新和肿瘤启动能力，是驱动肿瘤进展和促进转移的原因。CSCs具有高度的细胞可塑性，可根据TME基质或邻近细胞分泌的各种细胞因子、生长因子和形态因子等环境信号在EMT和间充质-上皮(MET)细胞之间转换。EMT通常位于侵袭肿瘤的边缘，与邻近的反应性基质密切接触。相比之下，MET是肿瘤远处转移的关键步骤，但其促转移能力较为有限。干细胞的可塑性及休眠能力可帮助其在转移级联过程中存活，包括癌细胞在原发部位的扩张、向内侵袭进入循环、向外侵袭远端器官以及最终在次级器官定植。

生物钟调节原发肿瘤侵袭前沿的CSCs和EMT细胞群

CSCs和EMT细胞群失去细胞间粘附并获得迁移能力。通常，它们处于休眠状态，但仍具有侵袭性和促转移性的潜力。针对CSC的分析揭示了“侵袭性”基因特征，包括NF-κB和RAS通路激活，并可以预测肿瘤转移的概率。此外，在乳腺癌中，高表达醛脱氢酶1 (ALDH1)高的细胞群更具有干细胞和/或祖细胞的特性，结肠CD133+ CD44+细胞在人类结直肠癌(CRC)中表现为肿瘤启动能力增强，间充质标记物n -钙粘蛋白高表达的CD26+亚群表现为侵袭性和迁移性增强，并可积极促进转移。综上所述，这些研究均提示CSCs是肿瘤转移的重要介质。

生物节律调控肿瘤播散

肿瘤细胞播散是肿瘤转移的重要步骤，也是肿瘤进展的关键标志。弥散细胞从原发肿瘤脱落，通过血管内渗作用进入循环系统形成循环肿瘤细胞(CTCs)，并从血管系统外渗，促进远端器官转移。循环的CSCs处于休眠状态，保持低免疫原性，并受到活化血小板的保护。

对有症状的多发性骨髓瘤患者骨髓和外周血样本中CTCs分析发现，其昼夜节律分布与CD34+细胞的模式相似。CTCs在患者休息期(04:00至12:00)达到峰值，表明CTCs在休息期优先转移到外周循环。在缺乏功能性生物钟的患者和小鼠的休息阶段，乳腺癌细胞容易以CTC的形式扩散到血液循环中，但CTC计数随着昼夜节律调节激素的作用而波动。这就提出了一个问题，即不同步的CTCs如何对患者的同步休息期作出反应。CTCs与血小板相互作用并激活血小板。血小板反过来保护CTCs免受免疫清除，并促进CTCs外渗到远处器官。在昼夜节律紊乱的条件下，血小板计数显著减少。CTC也以一种时间依赖的方式优先转移至外周循环，并保持高度增殖能力。针对CTCs的振荡模式进行干预可为易远处转移肿瘤的时间治疗提供新的理论依据。

生物钟可调节转移前生态位及肿瘤在远处器官的定植

除了原发肿瘤内部细胞之间的局部信号外，来自原发肿瘤的远程信号也会传播到远处的部位，为支持转移性CSCs向外浸润后的生长准备适宜的、与转移前相似的生态位。细胞外囊泡由原发肿瘤分泌，到达远处器官，促进上述转移前生态位的形成。最近的一项研究表明，参与细胞互作的细胞外囊泡受生物钟控制，其含量在夜间开始时达到峰值。在每2周交替的明暗周期光照干预中，血浆外泌体中生物钟基因的表达减少。

CSCs固有的肿瘤启动能力赋予它们在远端器官后建立转移性肿瘤的能力，这一过程可能与MET有关。这种MET过程增加了细胞间的粘附，并通过一种未知的机制使肿瘤在远端器官成功定植。血小板通过产生包括TGFβ在内的一系列血小板衍生因子，促进EMT、CSCs和CTCs的播种过程。减少该类因子的释放会抑制EMT过程，而此过程恰恰促进EMT到MET的转换，从而促进肿瘤定植。定植后，CSCs在有丝分裂刺激下退出细胞休眠并重新进入细胞周期。BMAL1-CLOCK复合物通过e -box介导的P1启动子抑制MYC转录，从而抑制细胞G0 - G1期的转换，这表明昼夜节律可使肿瘤细胞停滞在G0期，阻止其在远处器官内的增殖。相反，REV-ERBα和RORα抑制细胞周期抑制剂p21^cip1的转录，从而促进细胞周期过程，促进细胞从休眠到增殖的转变。因此，昼夜节律因子可以显著影响G0-G1和G1-S的转变，以调节细胞周期的再进入和进展，由此影响播散性肿瘤细胞的增殖状态及其在远处定植的能力。

生物钟调控CSCs及TME的交互作用

肿瘤相关免疫细胞、细胞基质和CSCs在生物钟的控制下表现出强大的、自动的节律振荡。在这里，作者着重描述了TME-CSCs相互作用的昼夜节律调节及其对肿瘤转移的贡献。

CSCs和免疫细胞

随着肿瘤的发生，新生CSCs迅速适应包括免疫抑制在内的局部组织的恶劣环境。多种免疫细胞群，如TAMs和骨髓源性抑制细胞(MDSCs)通过肿瘤肿块和CSCs分泌的信号蛋白募集到TME，从而抑制CD8+ T细胞和自然杀伤细胞的浸润和细胞毒性功能，而CD8+ T细胞和自然杀伤细胞是癌症免疫逃避的关键角色。目前，与昼夜节律中断诱导的肿瘤转移最相关的癌症类型是乳腺癌和胶质母细胞瘤(GBM)，这可能是由于它们具有激素和神经依赖性的特殊特征(图2)。在乳腺癌中，CJL改变细胞因子趋化因子网络，促进MDSCs、tam和CD4+ FOXP3+调节性T细胞群向肿瘤募集，从而通过增强CXCL5趋化因子与其受体CXCR2之间的相互作用，产生免疫抑制性TME。同时，CJL诱导Per2和Cry2表达降低，EMT基因表达上调，从而增加乳腺CSCs的发生频率，并促进EMT。这可增加CSCs的有效定植，促进骨髓和肺转移。抑制CXCR2可逆转CJL对肿瘤细胞播散的不利影响，从而阻止转移的发生。在GBM中，胶质瘤干细胞(glioma stem cells, GSCs)通过转录激活OLFML3(一种新的免疫抑制性小胶质细胞吸引趋化因子，受CLOCK调节)，将脑内巨噬细胞小胶质细胞招募到TME，从而触发免疫抑制。CLOCK耗竭降低OLFML3水平，从而抑制小胶质细胞浸润中的GSC自我更新。进一步研究发现，在GBM中存在CLOCK-OLFML3-HIF1α-lLGMN-CD162轴，提示TME中存在肿瘤内免疫抑制机制，该机制可保护CSCs免受免疫损伤(图2)。该轴的抑制导致CD8+ T细胞浸润增加，并与免疫检查点抑制剂抗程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)治疗发挥协同作用。

CSCs及肿瘤相关成纤维细胞

癌症相关成纤维细胞(CAFs)是TME的主要组成部分，与肿瘤细胞相互作用并促进转移。Bmal1的整体敲除可导致PAI-1表达降低，激活纤溶酶激活，使TGFβ水平升高，从而诱导肿瘤纤维化和CAFs向α-SMA⁺肌成纤维CAFs转变，从而促进结直肠癌和胰腺导管腺癌的肿瘤转移。细胞外基质提供了最佳的生物力学环境，并传递了关键的细胞外信号，以确保CSCs在生态位内的自我更新和分化。胶原蛋白是一种主要的分泌性细胞外基质成分，其合成和降解受到生物钟的影响。PER2是促进胶原沉积、CAF浸润并构建肿瘤抑制微环境的关键分子。这些研究表明，生物钟核心组件在基质细胞- CSCs相互作用中发挥重要作用，其中涉及TGFβ和其他未知的TME信号通路。

这些初步结果表明，CSCs和TME之间的相互作用是肿瘤转移的关键，突出表明其参与决定非CSCs和CSCs的特性(图2)。解开CSCs和TME之间复杂的功能关系，包括神经释放、激素分泌和代谢线索，是理解肿瘤进化过程中肿瘤内在和/或肿瘤外在昼夜节律功能的必要先决条件。

图2. CSC和TME之间的串扰促进了不同类型癌症的转移

临床相关性和治疗机遇

对昼夜节律网络与各种疾病之间相互作用的分子分析凸显了昼夜节律医学的治疗潜力。一项纳入 36 项研究（共 7,476 名癌症患者）的荟萃分析评估了量化时钟基因表达在口腔癌、乳腺癌、肺癌、肝癌和胃肠道癌等癌症中的预后价值。PER1 和 PER2 水平降低与分化不良、TNM（肿瘤、淋巴结、转移；恶性肿瘤分类）分期较差、转移增加和总体生存率降低相关。此外，时钟基因（CLOCK、PER1/2、CRY2、NPAS2 和 RORC）的表达与乳腺癌无转移生存率呈正相关。昼夜节律时钟功能在低度和非转移性肿瘤中得以维持，但在更不利的表型（例如 ER+、HER2+）中被破坏。临床样本研究表明，即使在整个肿瘤组织提取物中，肿瘤细胞亚群也能保持其自身有节奏的、细胞自主的时钟基因表达，尤其是在非 CSC 和 CSC 之间。当癌细胞可能出现心律失常或节律不齐或相位不一时，肿瘤内的 TME 成分可能通过分泌的细胞因子影响肿瘤细胞中的时钟基因表达，从而影响肿瘤对每日昼夜节律波动的生长和进展。基于分子昼夜节律时钟遗传决定因素的发现、免疫检查点抑制剂的开发以及其他突破性研究已开发出多种时间疗法。

靶向昼夜节律基因和CSCs

时钟基因与肿瘤转移之间的关系高度依赖于组织和环境。临床试验表明，治疗某些癌细胞类型（尤其是针对 CSC）的生物钟疗法益处仍然有限。BMAL1-CLOCK 复合负调节剂、REV-ERB 蛋白和 CRY 的小分子激动剂被开发用于靶向 CSC。使用 REV-ERB 激动剂 SR9009 和 SR9011治疗可在体内和体外诱导急性髓系白血病中的干细胞分化、神经胶质瘤癌症干细胞受损以及 GBM 中的细胞周期停滞和细胞凋亡。通过直接靶向 CRY1/2 基因通路，小分子 KL001 可以延长昼夜节律时钟的周期并降低其振幅。与分化型胶质母细胞瘤细胞相比，KL001 及其衍生物 SHP656 可通过诱导细胞周期停滞来降低胶质瘤 CSC 的自我更新能力，而不会损害正常脑细胞。ALDH 抑制剂 N,N-二乙氨基苯甲醛在 ALDH 活性较高时给药时对 4T1 乳腺 CSC (BCSC) 表现出增强的抗肿瘤和抗转移作用。

针对昼夜节律基因和TME成分

已经开发出针对转移的昼夜节律基因相关疗法，通过增强宿主对肿瘤的免疫反应。RORγ 结合并激活 BMAL1。其小分子激动剂 LYC-54143 和 LYC-53772 不仅通过提高 CD8+T 细胞的溶解能力来增强时钟幅度并抑制肿瘤发生和转移，而且还通过降低 MC38 小鼠结肠癌细胞的TME免疫抑制性 ，从而提高抗 PD-1 疗法的疗效。这些小分子药物也已在临床试验中进行了评估。一项 1 期试验显示，LYC-55716（cintirorgon）减少了胃食管癌和卵巢癌的复发和转移。因此，这些 ROR 调节剂作为有效的癌症治疗剂具有巨大的前景。因此，同时针对昼夜节律基因和TME成分可能很快会在时间免疫疗法中提供更有效的协同药物组合。

时间化疗和时间免疫疗法

临床试验已证明，在最佳时间使用抗癌药物具有益处。一项系统评价总结了 18 项（从 106 项中选出）随机对照临床试验，包括 2,547 名患者，以了解时间调节化疗的毒性和疗效。大多数研究中时间调节方案的原理是基于临床前研究发现的毒性降低以及昼夜节律对细胞增殖活动的影响。值得注意的是，这项研究表明，当结合时间调节化疗时，毒性显著降低，同时保持抗癌疗效（61% 的研究）。另外两项研究（17%）报告了疗效的提高，例如总体生存率和客观反应率。降低毒性使得应用更高剂量的化疗药物方案成为可能，从而获得更高的反应率。这是由 Lévi 及其同事在 1997 年的一项随机多中心试验中实现的（n = 186）；时间调节组中的转移性 CRC 患者接受了更高剂量的氟尿嘧啶和奥沙利铂治疗，导致治疗失败时间更长，反应率更高。

免疫检查点蛋白的发现和靶向作用代表了癌症治疗的突破。最近，两项独立研究表明，T 细胞活化所需的树突状细胞内的分子过程受昼夜节律控制，表现出明显的昼夜节律振荡（峰值在 ZT7，谷值在 ZT19）（图 2c）。树突状细胞和 CD8+T 细胞通过昼夜节律表达 CD80（CTLA-4 的共刺激分子，受 BMAL1 控制）发挥昼夜节律抗癌作用。BMAL1 的缺失消除了 CD80 表达的昼夜差异。因此，当与小鼠和人类树突状细胞在白天的节律同步（ZT9）时，癌症免疫疗法更有效。因此，这些发现表明时间免疫疗法可能是一种有前途的治疗选择。应进行前瞻性临床试验以促进更有效的免疫治疗方法。

论肿道麻 述评

在《Nature Cancer》杂志上发表的这篇视角文章中，作者们深入探讨了生物钟如何调节癌症干细胞（CSCs）和肿瘤微环境（TME）在肿瘤转移中的作用。文章首先介绍了生物钟的基本概念，即生物体内部约24小时的生理节律，这一节律通过基因表达和生化功能的精细调控来实现。生物钟的紊乱，如由夜班工作或时差反应引起的，与多种疾病的发生有关，包括糖尿病、肥胖、情绪障碍和癌症。特别地，生物钟的破坏与肿瘤的形成和转移有着密切的联系，这一点在动物模型和人类研究中均得到了证实。

文章进一步阐述了生物钟在分子水平上的机制，包括核心的转录-翻译反馈回路，这些回路涉及一系列复杂的基因和蛋白相互作用。作者们详细描述了这些分子机制如何影响CSCs的行为，包括它们的自我更新能力、对治疗的抵抗性以及在肿瘤微环境中的相互作用。特别引人注目的是，文章强调了生物钟对肿瘤细胞侵袭前沿的EMT过程的调控作用，这一过程在肿瘤的扩散和转移中起着至关重要的作用。

此外，文章还讨论了生物钟如何影响肿瘤细胞的传播和在远端器官的定植，这是肿瘤转移的两个关键步骤。作者们指出，肿瘤细胞的这些行为受到生物钟的严格控制，且与CSCs和TME之间的相互作用密切相关。文章还提出了一些重要的未解决问题，包括生物钟如何通过特定的信号通路影响CSCs与TME的相互作用，以及如何利用这些知识来开发新的癌症治疗策略。

在临床相关性方面，文章讨论了基于生物钟的癌症治疗策略，包括针对生物钟基因和CSCs的靶向治疗，以及基于时间的治疗（chrono-chemotherapy）和基于时间的免疫治疗（chrono-immunotherapy）。这些策略的目的是利用生物钟的节律性来提高治疗效果，减少副作用，并最终改善患者的预后。

总之，这篇文章为我们提供了一个全面而深入的视角，展示了生物钟在肿瘤转移中的多重作用，以及如何通过调节生物钟来开发新的癌症治疗策略。随着对生物钟与癌症之间复杂相互作用的进一步研究，我们有望在未来看到更多创新的治疗方法，以更有效地对抗这一全球性的健康挑战。

参考文献：

Roenneberg, T. & Merrow, M. The circadian clock and human health. Curr. Biol. 26, R432–R443 (2016).