1例难治性新型隐球菌性脑膜炎

前 言

隐球菌性脑膜炎是新型隐球菌经呼吸道吸入，在宿主免疫功能低下时，经血行播散感染中枢神经系统脑膜及脑实质的常见真菌感染性疾病。其临床表现多样、特异性差、病程长、预后差、病死率高。脑脊液中检测到病原菌是诊断隐球菌性脑膜炎最直接证据。

本案例为老年男性患者，患有“慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张”等多种慢性疾病、曾多次入院治疗。患者咳嗽加重，咳黄粘痰，伴头痛，发热来我院就诊。经临床和我科的检查确诊为新型隐球菌性脑膜炎，患者在治疗后，时有间断性头痛、发热等症状、治疗效果欠佳，脑脊液瑞氏-吉姆萨染色法中再次发现体积增大的新型隐球菌，临床及时改变治疗方案，最后确诊为难治性隐球菌性脑膜炎。

案例经过

患者：男 64岁 ，入院前20+年曾患“慢性乙型病毒性肝炎”，长期服用恩替卡韦抗病毒治疗，未复查。入院前3+年曾患“肺结核”，自诉已痊愈，入院前6月，因“右下肢静脉曲张”于外院行“右侧大静脉剥脱术”。患者反复咳嗽、咳痰，2年多，加重伴头痛、发热6+天，入院。头部MRI平扫+增强提示：右侧颞叶环形强化灶，脑干前缘脑膜强化。

实验室检查：白细胞数目：11.05×109/L，中性粒细胞数目：9.56×109/L，淋巴细胞数目：0.72×109/L，单核细胞数目：0.69×109/L，脑脊液生化：脑脊液蛋白：2589.6mg/L、糖：0.34mmol/L、钾：2.29mmol/L、钠：133.5mmol/L、氯：104.2mmol/L，脑脊液常规：潘氏试验：2+、白细胞计数：90×109/L，瑞氏-吉姆萨染色涂片镜检可见大量隐球菌（见图1）。

隐球菌墨汁染色：查见新型隐球菌；脑脊液细菌培养：：新型隐球菌阳性；脑脊液微生物二代测序DNA检验：新型隐球菌阳性（见图2）。临床予以两性霉素B、氟胞嘧啶抗感染治疗两周，效果欠佳，加用氟康唑氯化钠注射液（大扶康）继续抗隐球菌治疗，患者仍有发热，精神差；再次送检脑脊液常规瑞氏染色涂片中发现体积较大的新型隐球菌（见图5）。临床及时改变治疗方案予以两性霉素缓慢鞘内注射，最终确诊为难治性隐球菌性脑膜炎。

临床案例分析

患者为老年男性，患有“慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张”等较多基础疾病，提示其免疫力较低，有呕吐、发热、头痛等症状，提示颅内感染可能性，脑脊积液相关检查：常规瑞氏-吉姆萨染色、墨汁染色、脑脊液培养均提示隐球菌阳性。脑脊液微生物二代测序：隐球菌属：新生隐球菌--相对丰度：100%，进一步证实为新型隐球菌性脑膜炎。

在治疗过程中使用两性霉素B注射液、氟胞嘧啶抗感染治疗两周，患者时有发热、精神差，加用氟康唑氯化钠注射液（大扶康）继续治疗两周，患者症状仍时有反复，在治疗近1月后的脑脊液常规瑞氏染色涂片中还存在新型隐球菌，头部MRI平扫+增强提示：右侧颞叶环形强化灶，脑干前缘脑膜强化，与初入院是变化不明显。表明抗隐球菌治疗效果不佳，故调整治疗方案为：“两性霉素鞘内注射”。

检验案例分析

入院后完善相关检查：血常规：WBC 11.05×109/L↑，HB 135g/L，PLT 179×109/L，N 9.59×109/L↑，L 0.72×109/L，CRP：57.81 mg/L

肝肾功能：基本正常。乙肝肝炎病毒表面抗原：阳性，乙型肝炎病毒核心抗体：阳性，乙型肝炎病毒e抗体：阳性，丙肝抗原、抗体：阴性，HIV、梅毒阴性。

脑脊液检查：

脑脊液生化：脑脊液蛋白：2734.8mg/L↑， GLU 0.34mmol/L↓，K 2.29mmol/L↓，Na 133.5mmol/L↓，CL 104.2mmol/L↓

脑脊液常规：RBC 2590×109/L，WBC 90×109/L，中性粒细胞：88%↑，淋巴细胞：10%，单核细胞：2%，潘氏试验：2+↑，可见大量隐球菌。

瑞氏-吉姆萨染色法：

图1 隐球菌形态

图2 隐球菌形态

新型隐球菌形态特点：菌体大小不一、比淋巴细胞稍小，染深紫色、荚膜不易着色。

脑脊液培养：新型隐球菌少量

图3 脑脊液培养

脑脊液微生物二代测序：

图4 脑脊液微生物二代测序

诊断：新型隐球菌性脑膜炎

治疗1月后瑞氏-吉姆萨染色隐球菌特点

图5 治疗后隐球菌形态

临床治疗效果不佳：脑脊液中仍存在新型隐球菌，临床及时调整治疗方案为鞘内注射两性霉素B。最终诊断为：难治性新型隐球菌性脑膜炎。

知识拓展

新型隐球菌性脑膜炎（cryptococcal meningitis）是由新型隐球菌感染脑膜和（或）脑实质所致。由于其症状的不典型性及治疗的不规范，误诊率及病死率仍较高。近年来随着广谱抗生素、激素、免疫抑制药的广泛或不适当应用，以及免疫缺陷性疾病及器官移植患者的增加，该病罹患率呈增长趋势。

病原体多从呼吸道吸入，形成肺部病灶后经血液循环播散于脑膜。由于隐球菌性脑膜炎的亚急性发作及非特异性表现，因此及时诊断可能会有困难。对于任何伴有发热、头痛以及CNS相关体征或症状的免疫功能受损患者，或表现出亚急性或慢性脑膜炎的免疫功能正常个体，均应考虑新型隐球菌性脑膜炎的可能。

进一步行腰椎穿刺检查，若存在神经系统定位体征、视乳头水肿或精神状态受损的情况下，应行放射影像学检查。通过脑脊液培养、印度墨汁染色和/或隐球菌抗原检测来对脑脊液仔细评估应能明确诊断[1]。

隐球菌性脑膜炎疗程较长，具体疗程判定宜个体化，结合患者临床症状、体征消失，脑脊液常规、生化恢复正常，脑脊液涂片、培养阴性，可考虑停药，此外，有免疫功能低下基础疾病患者、脑脊液隐球菌涂片持续阳性、隐球菌特异多糖荚膜抗原检测持续高滴度，以及颅脑磁共振成像（MRI）示脑实质有异常病灶者疗程均宜相应延长。疗程通常10周以上，长者可达1~2年甚至更长，后期可口服氟康唑治疗[1]

目前对于难治性隐球菌性脑膜炎没有明确的定义，多指治疗后脑脊液培养持续阳性，临床症状和体征持续无改善，或者尽管抗真菌治疗患者仍因疾病进展而死亡。有文献报道鞘内或脑室内注射两性霉素B联合静脉抗真菌疗效高于仅用静脉治疗，因此针对难治性病例，全身静脉抗真菌治疗失败时，鞘内或脑室内注射可用于补救治疗，但需注意避免并发症的发生[1]

新型隐球菌呈圆形或卵圆形，外裹由细胞壁和荚膜组成的被膜，广泛存在于土壤、蔬菜、牛奶、草地及鸽粪中。新生隐球菌是一种机会致病真菌，感染机体后随宿主内环境的改变，如温度、PH、氧化酶、渗透压的改变等，都会迫使真菌病原体作用出相应的生长、分化及繁殖方式的调整[2]。

有研究报道致病性真菌为了适应不同的外环境，使其在宿主体内生存，在与宿主互相作用的过程中可能发生形态学改变。隐球菌菌体外包绕的厚壁荚膜是隐球菌最显着的形态学特征，荚膜大小与生长环境有密切关系，标准培养基和外界环境中隐球菌荚膜较小，而宿主肺泡内和巨噬细胞内隐球菌荚膜体积明显增大[2-4]。

巨噬细胞的吞噬和杀伤作用是天然免疫过程中至关重要的环节，隐球菌胞壁外的荚膜、脱落至宿主内环境中的荚膜和吞噬细胞内脱落的荚膜可通过多种机制保护隐球菌免受宿主杀伤。已有研究发现，隐球菌荚膜体积与抗体和补体介导的巨噬细胞吞噬作用呈负相关， 即荚膜越大，越不易被吞噬；且荚膜增大后，内层原有荚膜密度增大，可明显减少外源性物质的渗透[5]？有学者在隐球菌患者的肺？脑和脑膜组织中发现巨型隐球菌，菌体直径可达25~30μm，而体外培养的酵母样隐球菌的 菌体平均直径为4.5μm？

Zaragoza等发现，经呼吸道感染的免疫力正常小鼠，肺组织中巨大菌体占所有隐球菌的10%~80%，且肺内隐球菌接种量的 多少与巨型隐球菌产生比例成反比？Okagaki等发现，小鼠经呼吸道接种隐球菌3d后，肺组织中菌体直径>10μm的隐球菌约占20%，部分菌体直径甚至达到50~100μm(不包括荚膜)[6]？由此可见隐球菌在机体中形态可呈多样性？检验人员应掌握隐球菌的各种形态特点，避免漏检？

案例总结

该例患者患有“慢性阻塞性肺疾病？支气管扩张”等多种慢性疾病，出现反复头痛？发热，脑脊中找到隐球菌为临床诊断排除其它感染，明确病因？在治疗过程中患者治疗效果不佳，脑脊液中再次发现隐球菌，临床更明确的认识治疗效果不佳是由隐球菌引起的，排除了其它原因，临床治疗方案由静脉注射两性霉素改为鞘内注射？因此脑脊液检查中是否找到隐球菌对临床诊断？治疗方案实施及治疗疗程具有指导意义？

本案例的隐球菌在瑞氏-吉姆萨染色法中治疗前和治疗后的形态特点差异较大，治疗前(见图1-2)菌体大小不一？染深紫色？比淋巴细胞稍小？治疗后的隐球菌(见图5)：菌体明显增大，基本不着色，呈无结构的圆形？由此可见隐球菌在体内形态呈多样性，尤其是治疗后，由于内环境的改变或药物的影响，其形态特点变化可能会更大，因此对检验人员的形态识别能力要求较高，检验人员需掌握隐球菌的各种形态特点，才不会造成漏诊？

专家点评

成都市第三人民医院检验科 张玲 主任检验师

本案例为一长期罹患多种慢性疾病的老年患者，因持续咳嗽并伴发热？头痛前来我院就诊？临床医师依据患者的表现选择了脑脊液的检查，实验室检查多项结果显示隐球菌阳性，为临床确诊隐球菌性脑膜炎提供了直接证据，实验室也为临床提供了药敏数据作为治疗参考？该患者通过治疗后症状仍然存在，再次检查脑脊液发现变形变大的隐球菌，证实了治疗效果不佳的直接原因，由此临床及时更改治疗方案为鞘内注射药物，？本案例完整的展示了实验室在临床诊疗中起到的重要指导作用，值得分享？

参考文献

[1]刘正印，王强贵，朱利平，吕晓菊等隐球菌性脑膜炎诊治专家共识《中华内科杂志》2018，57，5(317)：323

[2]潘搏等，隐球菌形态学变化及其致病机制微生物与感染 Journal of Microbes and Infections，June25，2012，7(2)：121-125 http：∥jmi.fudan.edu.Cn

[3]Feldmesser M，Kress Y，Casadevall A.Dynamic changes in the morphology of Cryptococcusne of ormans during murine pulmonary infection [J].Microbiology，2001，147(Pt8)： 2355-2365.

[4]Zaragoza O，Chrisman CJ，Castelli MV，et al.Capsule enlargement in Cryptooccusne of ormans confers resistance to oxidatives tresssuggestinga mechanismforintracellular survival[J].CellMicrobiol，2008，10(10)：2043-2057.

[5]ZaragozaO，TabordaCP，CasadevallA.Theefficacyof complement-mediatedphagocytosisofCryptococcusneofor- mansisdependentonthelocationofC3inthepolysaccha- ridecapsuleandinvolvesbothdirectandindirectC3-media- tedinteractions [J].Eur J Immunol，2003，33 (7)： 1957-1967

[6]OkagakiLH，Strain AK，NielsenJN，CharlierC，Baltes NJ，Chrétien F， Heitman J， Dromer F， Nielsen K. Cryptococcalcellmorphologyaffectshostcellinteractions and pathogenicity [J]. PLoS Pathog，2010，6 (6)： e1000953