Nature子刊：高光坪综述腺相关病毒基因治疗明星载体

近日，权威期刊Nature Reviews Drug Discovery针对“腺相关病毒(AAV)载体作为基因治疗递送的平台”展开讨论，其中通讯作者为国际基因治疗领域著名专家、美国基因与细胞学会当选主席高光坪教授，同时他也是Voyager Therapeutics的创始人之一。

腺病毒相关病毒(AAV)最早是在20世纪60年代中期从实验室腺病毒(AdV)制剂中发现的，并且很快就在人体组织中发现。

在纯科学的好奇心驱使下，一些研究小组开始了解基本AAV生物学的过程，此时并没有意识到其作为人类基因治疗平台的巨大潜力。在AAV研究的前15-20年中，AAV的几个重要方面被表征，包括其基因组构型和组成、DNA复制和转录、感染潜伏期和病毒粒子组装。这些成果共同促进了野生型AAV2序列成功克隆到质粒中，从而实现了基因研究和整个AAV2基因组测序。早期研究提供了使用AAV作为基因传递载体的基础知识。

50年AAV时间线（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）

现如今，重组AAV(rAAV)已经成为体内基因治疗递送的主要平台。第一种rAAV基因治疗产品是uniQure公司的alipogene tiparvovec(Glybera)，于2012年被欧洲药品管理局(EMA)批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症；2018年，FDA批准了voretigene neparvovec-rzyl(Luxturna)，这是第一个获得美国许可的rAAV基因疗法。

作为病毒

AAV属于细小病毒科，Dependoparvovirus属。它的生命周期依赖于辅助病毒的存在，例如AdV。AAV存在于多种脊椎动物中，包括人类和非人类灵长类动物(NHP)。目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。

它由直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和~4.7 kb的单链DNA基因组组成。衣壳包含三种类型的亚基VP1、VP2和VP3，总共60种拷贝，比例为1:1:10(VP1:VP2:VP3)。基因组的两端是两个T形反向末端重复序列(ITR)，其末端主要用作病毒复制起点和包装信号。rep基因编码病毒复制所需的四种蛋白质；它们以其分子量命名：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。cap基因通过来自不同起始密码子的可变剪接和翻译编码三个衣壳亚基。此外，编码组装活化蛋白(AAP)的第三个基因在不同阅读框中的cap编码序列内编码，并且已显示出促进病毒粒子组装。

AAV和AAV载体的基因组结构（图片来源：Semantic Scholar）

AAV基因组可以整合到人细胞中称为AAVS1的基因组基因座中以建立潜伏期。这种现象部分是由于AAVS1中发现的序列相似性以及ITR和Rep活性。如下所述，因为rAAV缺乏rep基因，所以rAAV基因组整合大大减少。

作为基因治疗递送载体

实际上，rAAV由与野生型AAV(wtAAV)中发现的相同的衣壳序列和结构组成。然而，rAAV包装的基因组删除了全部AAV蛋白编码序列，并且添加治疗性基因表达盒。唯一的病毒来源序列是ITR，它们是在载体生产过程中指导基因组复制和包装所必需的。病毒编码序列的完全去除使rAAV的包装能力最大化，并且有助于它们在体内递送时的低免疫原性和细胞毒性。

rAAV最佳地装载5.0kb以下的基因组，因此必须仔细设计有效负载，不仅要考虑治疗性转基因序列，还要考虑基因表达所必需的调控元件(例如，启动子和多聚腺苷酸化信号)。

一旦将rAAV施用于患者，影响基因递送效力的宿主因子就起作用。例如，新发现表明不同血清型以不同方式与血清蛋白相互作用。尽管如此，rAAV的有效性在很大程度上取决于衣壳和靶细胞表面受体之间的分子相互作用，以及随后颗粒内化后的下游事件。

rAAV转导通路（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）

rAAV的复制和包装依赖于宿主细胞因子和辅助病毒提供的元件，如单纯疱疹病毒(HSV)和AdV。因此，鉴于现有技术，用于生产rAAV的无细胞系统仍然难以实现。开发增强rAAV生产效率的方法一直是人类应用的持续挑战。

关键点：rAAV的长期存在是否可以通过载体基因组整合导致遗传毒性？

腺相关病毒(AAV)作为基因治疗载体的最有希望的属性之一是，其在人类中的低遗传毒性特征，以及缺乏强有力的直接证据表明rAAV可以在人类中引起载体基因组介导的宿主遗传毒性。普遍的想法是rAAV基因组仍然主要以附加体(episome)的形式存在于宿主细胞核。

肝细胞癌(HCC)和AAV载体整合之间的关联首次报道于2007年，并通过载体基因组的同源定向整合正式证实。推动整合的确切机制尚不完全清楚，也未达成共识。

在细胞培养模型和特定条件下的小鼠中的研究证明，rAAV基因组的整合在高感染复数下发生，并且表现出优先整合到Rian基因组基因座中，该基因座是鼠基因组特有的区域。这些报告目前被认为与临床环境无关。重要的是，对患者样本(给药后1年)和非人类灵长类动物(注射后1个月)的研究表明，整合的可能性很低并且缺乏在已知的HCC驱动基因附近的整合。

由于rAAV在临床试验中的安全记录和在该领域内的共识，很少有工作专门针对限制基因毒性整合事件的策略。尽管如此，通过调节控制盒限制附近基因反式激活的绝缘子元件的设计有望减少由于杂散整合引起的遗传毒性效应。

关于载体设计

rAAV衣壳的开发

自然发现、合理设计、定向进化和计算机生物信息学方法。

衣壳发现和工程的四种主要方法（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery ）

rAAV基因组设计和工程

要点一：控制转基因表达水平和特异性

在许多情况下，rAAV基因治疗平台利用强大且普遍存在的启动子以实现高效转基因表达。这些启动子包括巨细胞病毒(CMV)启动子和与CMV增强子融合的鸡β-肌动蛋白启动子(CβA)。其他调控元件也可以增强基因表达，例如内含子和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。

此外，转基因序列本身的元件也可影响表达，例如GC含量、隐蔽性剪接位点、转录终止信号、影响RNA稳定性的基序和核酸二级结构。因此，密码子优化广泛用于rAAV基因治疗，旨在增强基因表达。在翻译水平，包含Kozak序列可以进一步增加蛋白质表达。值得注意的是，高转基因表达水平并不总是优选的。蛋白质或RNA分子的超生理表达可能是有毒的。

表达特异性是基因治疗的另一个重要方面。非靶组织或细胞类型中的基因表达可能导致毒性或引发不需要的免疫应答。相关策略包括使用组织或细胞类型特异性启动子并在3'-非翻译区(UTR)中掺入miRNA结合位点以从中去除富含miRNA的细胞的表达。

要点二：容纳大型转基因

与其他病毒载体相比，AAV载体的一个限制是它们的小包装尺寸(~5.0kb，包括ITR)。一个看似简单的解决方法是设计一个缩短版本的基因，编码截短但功能性的蛋白质。

要点三：增强耐久性

尽管rAAV是基因治疗的有利载体，但它们仍然是非复制性附加体。因此，转导的载体基因组在有丝分裂细胞中逐渐丧失，为此已经探索在复制细胞中保留转基因表达的策略。在复制细胞类型中实现延长转基因表达的最直接方法是促进rAAV基因组整合，但这种罕见和无监督的整合事件通常导致部分基因组整合，因此不能达到理想的治疗目的。

基因编辑提供了一种有希望的解决方案，通过靶向基因组整合来增强耐久性。一旦可编程核酸酶在靶基因组基因座中引入DNA断裂，宿主细胞的同源定向修复(HDR)途径可以使用rAAV基因组作为供体模板，促使治疗基因盒的精确和可遗传的插入到宿主基因组。如果核酸酶也被用于切割rAAV基因组，则可以通过同源非依赖性靶向插入将释放的携带治疗基因盒的双链线性DNA片段插入靶基因组基因座。

最近，无核酸酶同源重组定向整合作为基因编辑的替代方法获得了关注。这种现象通过将与基因组靶位点同源的侧翼片段插入载体基因组来起作用。通过这种方式，可以实现序列的稳定整合，而无需通过核酸酶引入DNA断裂。

此外，已经探索了通过将支架/基质附着区(S/MAR)序列插入构建体中，以使游离体形式能够在转导细胞中复制的策略。S/MARs在质粒构建中的应用已经被用于数百个细胞的长期基因表达。

临床应用转化

截至2018年11月13日，145例涉及rAAV临床试验已经在ClinicalTrials.gov注册。

rAAV基因治疗临床试验概况（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）

如前所述，迄今为止有两种载体化的AAV血清型获得了用于患者商业用途的监管批准：AAV1(Glybera; uniQure)和AAV2(Luxturna; Spark Therapeutics)。目前在临床试验中使用的AAV载体少于12种血清型，其中使用频率最高的是AAV2。值得注意的是，更新和更有效的衣壳，如AAV8、AAV9和AAVrh.10正在用于越来越多的试验。

大多数临床试验的治疗策略涉及基因替代(gene replacement)，用于治疗单基因隐性疾病。通常进行I/II期试验以加快产品开发。

下图列举了部分正在进行的相关临床试验。

（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）

针对的靶组织

考虑到AAV的天然趋向性和未满足的医疗需求，大多数rAAV基因治疗计划集中于肝脏、横纹肌和中枢神经系统(CNS)。

• 几乎所有天然AAV衣壳都可以在全身给药后有效地转导肝脏。因此，rAAVs提供了一个强大的肝靶向平台来治疗各种疾病，如A型血友病和B型血友病、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症和Crigler-Najjar综合征。

• 诸如AAV8和AAV9的衣壳，可以靶向全身的多种肌肉类型，使得能够针对多种肌肉疾病开发rAAV基因疗法，特别是那些影响全身肌肉的疾病，例如DMD。值得注意的是，转导的肌肉可以作为生物工厂来产生用于治疗非肌肉疾病的分泌治疗性蛋白质。

• 此外，虽然大多数心脏病是多基因的并且受环境因素的影响，但已经测试了几种参与信号传导和代谢的基因来治疗心力衰竭。

• 临床开发中大部分的rAAV基因疗法集中在CNS，包括大脑和眼睛。

眼睛是一种封闭的和分隔的器官，这促使rAAV基因的局部递送。值得注意的是，FDA批准的第一种rAAV基因治疗药物Luxturna，用于治疗患有由RPE65基因突变引起的遗传性视力丧失的患者。

相比之下，大脑更复杂，更大。直接脑实质内rAAV注射可以促使rAAV的局部分布，并且理想地用于治疗影响脑部限定区域的CNS疾病，例如帕金森病中的壳核。另一方面，通过鞘内注射递送到脑脊液空间可以实现更广泛的CNS分布。不幸的是，这些给药途径可能是侵入性的并且带来潜在的风险。

或者，静脉内递送某些血清型载体，例如AAV9和AAVrh.10，使载体穿过血脑屏障(BBB)以转导神经元和神经胶质细胞。这一具有里程碑意义的发现促成了一系列研究，证明了全身性rAAV给药的治疗效果，其目标是影响CNS广泛区域的疾病，包括脊髓性肌萎缩症(SMA)、肌萎缩侧索硬化、Canavan病、GM1 ganglio-sidosis和粘多糖贮积症III型。利用这种强大的rAAV平台的多项临床试验目前正在进行中。

治疗策略

1、基因替代（gene replacement）

该策略旨在提供基因产物以补偿功能丧失突变。基因替代适用于治疗隐性单基因疾病，并且已经获得了最大的临床成功，如已上市的Glybera和Luxturna。

2、基因沉默（gene silencing）

与基因替代相反，基因沉默主要解决由毒性增加突变引起的单基因疾病，例如亨廷顿病。鉴于抑制基因表达的效力，RNAi策略目前主导基于rAAV的基因沉默平台。然而，与快速发展的合成RNAi疗法相比，基于rAAV的RNAi疗法大多仍处于临床前开发阶段。近日，uniQure公司针对亨廷顿病的AMT-031 IND申请获FDA批准。

3、基因添加（gene addition）

除了单基因疾病外，rAAV介导的基因治疗还有可能通过基因添加来解决复杂的遗传疾病和后天性疾病。人类疾病，如心力衰竭和传染病，代表了一些最紧迫的未满足的医疗需求。基因添加可以多种方式调节这些疾病，例如为神经疾病提供神经营养因子、调整心力衰竭和癌症的信号传导途径。

此外，基因添加策略可通过rAAV递送编码中和致命病毒感染的重组抗体的基因。这些平台利用肌肉内递送并将转导的肌肉细胞转化为生物工厂，以产生分泌到血流中的治疗性抗体。

该策略目前正在临床上用于HIV感染。一个挑战是对抗体增强免疫力，因为它们可以被认为是外来蛋白质。该抗体应答可以将循环抗体浓度抑制到低于目标阈值，从而限制功效。 rAAV相关的免疫应答在下面进一步讨论。

4、基因编辑（gene editing）

近年来，快速发展的基因编辑技术提供了一个多功能工具箱，可直接修复人类疾病的相关突变。治疗性基因编辑通常分两步进行：在基因组中产生目标DNA断裂和DNA修复，最终发生所需的DNA改变。

已经开发了一系列可编程核酸酶以产生DNA断裂，例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR相关(Cas)蛋白。

例如，针对溶酶体贮存失调的第一个在体rAAV基因编辑临床试验正在进行中。该策略利用ZFN平台将治疗基因精确地插入白蛋白基因座以驱动肝细胞中的转基因表达。

作为一种强大的治疗基因编辑方法，基础编辑已经初显潜力，它可直接将一个碱基对转换为另一个碱基对，而不会产生双链DNA断裂。

主要挑战

大规模制造和成本

药物产品的可负担性已经成为了基于AAV的基因疗法的主要障碍。例如，Glybera仍然是世界上最昂贵药物，每名患者的价格为100万欧元(约合120万美元)，并且已经退市。Luxturna于2017年推出，价格同样高昂，每只眼睛的治疗价格为42.5万美元。

价格主要归因于制造的高成本。要想生产足够的载体用于治疗，需要大量的资源和专业知识以及合适的生产系统。

通常，研究级和临床级载体通过质粒DNA三重转染到贴壁的真核细胞生产。然而，缩放该系统是昂贵的，因为大规模生产需要增加生长包装细胞系所需的表面积。基于此，HEK293细胞已经可以在生物反应器中悬浮培养，每升产生超过1×10^14个载体基因组。

尽管取得了这些进步，但三质粒转染系统仍然效率低下，因为并非所有细胞都能获得有效包装所需质粒的最佳比例。质粒不平衡也可能导致载体批次之间空 - 全衣壳比率的变化。

重组杆状病毒平台已广泛用于在Sf9细胞中大规模生产rAAV，因为它们易于在高细胞密度下进行悬浮培养。事实上，Glybera是利用这种方法生产的。然而，这些方法仅对有限数量的患者是足够的，因为有效的剂量可能非常高。

尽管通过rAAV载体治疗单基因疾病现在变得比以往任何时候都更加可行，但是高风险和高成本开发阻碍了许多研究者将临床前研究转变为临床试验。影响生产成本的因素存在于许多方面，例如从细胞和病毒杂质中纯化rAAV颗粒和去除AAV空衣壳的困难、缺乏标准化(很多时候由于载体衣壳变异的差异)和载体效力在固有的批次间差异。

免疫障碍

rAAV蛋白衣壳、其DNA基因组和转基因的蛋白质产物可以在多个阶段与宿主免疫系统相互作用，对有效基因递送和持久基因表达构成障碍。

影响rAAV基因递送的免疫学障碍（图片来源：Nature Reviews Drug Discovery）

第一个屏障涉及中和抗体(NAb)，其针对与wtAAV的衣壳相同或相似的rAAV衣壳。由于天然wtAAV感染，在大部分人群中发现血液循环中的NAb，并且可以有效地阻断rAAV基因递送，尤其是在静脉内注射后。具有免疫特权的大脑可以在CNS直接递送后耐受稍高的NAb滴度，但不能完全屏蔽其影响。

已经开发了几种策略来克服这种障碍，但目前，NAb筛查和排除血清反应阳性受试者仍然是许多临床研究中的必要步骤。在rAAV给药后，载体衣壳引发强烈的体液免疫反应以产生NAb，在大多数情况下阻止再次给药。对于可能需要重复给药的应用，可以考虑在第一次注射时利用瞬时B细胞耗竭和雷帕霉素诱导免疫耐受。

此外，衣壳可以触发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的细胞毒性，这可能导致转导细胞的清除，从而导致转基因表达的丧失。这种现象在人类中尤为突出，并且不容易在动物中建模。应该注意的是，针对rAAV衣壳的CTL应答比针对其他病毒载体(例如腺病毒载体)的CTL应答要弱得多。

由rAAV施用引起的CTL反应可能随着时间的推移而损害治疗功效，但通常不会引起主要的安全性问题。一些肌肉靶向临床研究表明，调节性T(Treg)细胞可能在抑制CD8+ CTL中发挥作用。使用类固醇对CD8+ T细胞进行药理学抑制可有效控制系统性rAAV传递后肝脏CTL应答，并确保长期转基因表达。受肌肉指导的rAAV基因治疗中内源性Treg细胞的诱导及其在限制CTL反应中的潜在作用的启发，给予自体Treg细胞作为体内基因转移的佐剂可以为调节rAAV免疫提供强有力的方法。

转基因可以编码一种对宿主来说是外来的蛋白质。因此，转基因产物可以触发B细胞介导的和T细胞介导的适应性反应，以产生转基因产物特异性抗体和CTL。循环抗体可能会阻止持久的治疗效果。同样，抗体反应目前是开发用于传染病的AAV载体的主要障碍。在肌肉靶向临床试验中报道了转基因产物特异性CTL反应，但在肝脏靶向的血友病试验中没有报道，这可能是由于肝脏的致耐受能力。鉴于此，建立必要的入组标准可能有助于减轻这种风险。

除了引发适应性反应外，rAAV衣壳和载体基因组也可能在递送后不久通过Toll样受体2的先天免疫感知。这种反应导致促炎细胞因子的产生并促进适应性反应。自身互补的rAAV基因组或具有高GC含量的载体基因组显示出进一步增强先天免疫应答。因此，通过耗尽rAAV基因组中的CpG二核苷酸来预防TLR信号传导具有增强rAAV介导的基因表达的潜力。另一种有希望的策略是将TLR9抑制性DNA序列(例如源自人端粒的TTAGGG的多拷贝)掺入rAAV基因组中以逃避先天免疫监视。据报道，该方法降低了与小鼠中rAAV递送相关的免疫应答。

展望

基因疗法代表了治愈人类疾病的前沿之一。目前使用AAV载体进行临床试验的呈指数增长，随着AAV领域的不断扩大，将继续推动基因治疗药物的开发。

人类基因组计划已经实现了基因组的近乎完整的注释。此外，全基因组关联研究项目和探索表观基因组的大数据研究提供了将遗传差异与疾病联系起来的蓝图。这些成就使我们处于非常令人兴奋的基因组学和基因治疗时代的中间。

综合各科学专业知识，充分利用rAAV基因治疗的前景并克服当前的挑战，将有助于开发创新药物。