国产宫颈癌疫苗蓄势待发！探秘大肠杆菌疫苗工厂 ——专访厦门大学公共卫生学院院长夏宁邵教授
2018-01-04 佚名 学术经纬
一个世纪以前，肿瘤病毒研究先驱Rous Peyton率先提出无细胞过滤因子可致禽类肉瘤，语出惊人的实验结论并未引起世人的关注与认可；半个世纪后，耄耋之年的Rous Peyton才因此研究而获得诺贝尔奖。时至今日，多种导致动物肿瘤的病毒被先后确认，而HPV病毒与女性宫颈癌之间的关联无疑最为引人注目。
一个世纪以前，肿瘤病毒研究先驱Rous Peyton率先提出无细胞过滤因子可致禽类肉瘤，语出惊人的实验结论并未引起世人的关注与认可；半个世纪后，耄耋之年的Rous Peyton才因此研究而获得诺贝尔奖。时至今日，多种导致动物肿瘤的病毒被先后确认，而HPV病毒与女性宫颈癌之间的关联无疑最为引人注目。
但若仅将HPV与宫颈癌画上等号却失之片面：HPV（Human papillomavirus，人类乳头瘤病毒）有上百种亚型，不只是侵袭全球90%以上宫颈癌病患的元凶，还可导致扁平疣、尖锐湿疣等顽固皮肤病，以及口腔癌、直肠癌、膀胱癌等多种妇科以外的癌症。无怪乎过去多年内，许多人特地前往香港甚至海外注射HPV疫苗。2017年8月起，进口二价、四价HPV疫苗相继登陆内地，但高昂的接种价格可能会阻碍其普及推广；另外，HPV诸多亚型之间的蛋白同源性较差，目前西方防疫功能最为强大的也只有九价疫苗。
厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心主任夏宁邵教授带领团队，从2002年起研究HPV抗原组装及疫苗生产工艺。至2017年底，国产第一代二价HPV疫苗终于结束3期临床试验，第二代九价疫苗也已获得CFDA临床批件。目前夏教授团队已开始第三代二十价HPV疫苗概念验证研究，不仅保护率预计达到99%以上，还将以更强大的防疫功能和低于进口疫苗的价格，走在全球HPV病毒研究的前列。
十五年磨一剑：国人翘首企盼的本土HPV疫苗
·HPV病毒可以导致多种疾病，在中国人群中感染率也很高。请您介绍一下该病毒对人体造成的健康威胁，以及您团队研发HPV疫苗的历程。
夏宁邵教授：HPV是目前已确证可导致人类癌症的病原体，所以对于该病毒感染的诊断和治疗可有效预防宫颈癌等恶性肿瘤。HPV亚型上百种，在全球人口中感染率很高，但只有高危亚型的长时间持续感染才会导致癌症。而从HPV感染到宫颈癌发生，平均需要8-10年的时间。现在全球每年新增近50万宫颈癌新发病例，中国占1/5，是仅次于乳腺癌的第二大女性癌症。除此之外，高危亚型HPV还可能引发口腔癌、膀胱癌、直肠癌等癌症，因此HPV疫苗对于年轻女性以及青少年男性都具有重要的免疫意义。
HPV疫苗研制的难点在于各类亚型蛋白差异较大，单价疫苗无法交叉预防所有病毒，所以科学家需要研究能覆盖多种高危亚型的疫苗。2006年，默沙东推出基于酵母真核表达系统的全球首个HPV疫苗（16/18/6/11四价）；2008年，GSK推出基于昆虫细胞-杆状病毒真核表达系统的第二个HPV疫苗（16/18二价）。进口疫苗价格较昂贵，质优价廉的国产HPV疫苗是我国重大的民生需求，因此我们中心综合国内需求和技术成熟度采取了分代研究策略。
▲HPV病毒构型（图片来源：Europe Bioinformatics Institute）
HPV疫苗候选抗原L1蛋白有多对半胱氨酸，通过大肠杆菌表达后的抗原需要在体外形成L1蛋白五聚体，并组装成类似于天然病毒的类病毒颗粒，才能发挥疫苗的作用。制备该抗原的关键在于让多个半胱氨酸残基精准配对，并形成正确的二硫键以及构象正确的五聚体。经过整整15年的摸索，中心突破了从L1蛋白到五聚体再到类病毒颗粒的全链条关键技术。到2017年底，我们研制的中国首个二价HPV疫苗已完成临床试验；全球第二个九价HPV疫苗，可预防HPV 16/18/6/11/31/33/45/52/58九个亚型，使保护率在第一代70%的基础上提高至90%，目前已获得临床批件。另外，可预防20种亚型HPV病毒的第三代疫苗，也已处于实验室的概念验证阶段。我国第一代HPV疫苗的上市进程与国外相比差距超过十年，而第三代HPV疫苗则有望走在全球前列，形成“从跟踪到并跑，再走向引领”的发展道路。
·除了HPV疫苗，您的团队还在全球范围内首先鉴定出了两个戊肝病毒中和表位，并继而推出了世界上首个戊肝疫苗。请您谈谈戊肝在国内外的流行病学基本特征，以及疫苗研发的过程。
夏宁邵教授：在所有病毒性肝炎种类中，甲、乙、丙型肝炎都广为人知，甲、乙型肝炎疫苗在婴幼儿人群中的普及推广也起到很好的免疫效果。其实全球每年戊肝病毒感染者也超过2000万人，死亡病例超过5.7万。虽然戊肝病毒主要在饮用水质恶劣的南亚、战乱横行的非洲一些区域爆发，但因为公众认知度和免疫措施不足，中国戊肝发病人数已在逐年上升且已超过甲肝感染者。该病毒对孕妇、有基础性肝病患者、免疫抑制人群的威胁甚大，可导致肝衰竭和70%的高死亡率。
过去学术界已经发现免疫优势构象型戊肝抗原决定簇位于结构蛋白pORF2，但之后众多利用基因工程技术表达纯化高活性pORF2的努力均归于失败。我们团队利用蛋白质突变技术，证实戊肝免疫优势抗原决定簇的正确形成依赖于蛋白多聚体的形成，其核心区段位于ORF2的459-602位氨基酸，且597-603位氨基酸是聚体形成的关键区域，这成为我们研发戊肝疫苗原始创新的起点。之后我们成功表达并纯化了能形成优势抗原决定簇的最小蛋白片段E2s（ORF2的459-602位氨基酸），以及与颗粒化密切相关的数个结构域，我们基于这些核心发现成功生产了用于临床试验的候选疫苗。
▲图片来源：夏宁邵课题组
戊肝疫苗（益可宁，Hecolin）在2009年终于完成3期临床试验，2012年在国内正式上市。整整14年，超过200名工作者夜以继日地用青春与汗水，将为公众谋求健康福祉的理想变为现实！目前比尔及梅琳达？盖茨基金会（BMGF）、国际疫苗研究所（IVI）等多个国际组织正合作推动戊肝疫苗国际化；2017年5月，戊肝疫苗专题会议在WHO总部召开，为益可宁？取得WHO预认证（PQ）做前期准备工作。因为南亚、非洲有不少国家为戊肝高发区，所以该疫苗在海外推广也必将为一带一路战略贡献力量。
点石成金：原核细胞化身疫苗工厂
·您目前主要研发的疫苗属于基因工程疫苗，请您谈谈这类疫苗与传统疫苗之间的区别。
夏宁邵教授：目前市场上较为常见的传统疫苗，多数仍然以完整的病原体作为抗原，对于无法大量培养的病原体则无能为力；减毒疫苗无法杜绝感染、过敏风险，灭活工艺不稳定则可能导致抗原结构破坏和接种效果下降。我们中心目前研发的疫苗则属于基因工程疫苗，即利用模式细胞培养病原体的免疫优势抗原决定簇，所以基因工程疫苗只带有病原体的一个或数个亚单位蛋白，无感染能力但却带有很强的免疫原性。此类疫苗生产成本更低，而且更有利于制作多价疫苗。
目前上市的乙肝疫苗、戊肝疫苗、HPV疫苗都属于基因工程疫苗，此类疫苗研发所采用的病毒表达系统主要以昆虫细胞-杆状病毒、酵母细胞、哺乳细胞等真核细胞为主。因为真核细胞具有与人体细胞接近的细胞核和大型细胞器结构，所以依靠真核细胞表达的重组蛋白，可以实现更相似于人体细胞的各种翻译后修饰。但真核细胞种类差异较大，培养出的抗原也存在表达量不稳定、免疫性参差不齐、提纯难度不一的特点，而且通过真核细胞进行疫苗制备的成本较高，如采用哺乳动物细胞则抗原表达量较低、制备繁琐、价格极高。
因此我们多年来坚持利用大肠杆菌的原核细胞系作为研究对象，这也是我们能够研制出质优价廉疫苗的关键。2004年我们研发的戊肝疫苗刚刚获得临床批件，当时各方还普遍认为原核细胞无法大规模制造基因工程疫苗，但我们基于对前期坚实试验数据的信心，顶住压力完成了疫苗的制备和临床试验，且得到了符合预期的试验效果。
▲图片来源：夏宁邵课题组
·您团队采用的大肠杆菌平台，曾被基因工程乙肝疫苗发明人William Rutter给予高度评价。该病毒表达系统有哪些具体的优势和局限？除了基因工程疫苗，您的团队是否也采用其他技术手段来制备疫苗？
夏宁邵教授：每一种蛋白的表达系统都有自己的优势与局限性。大肠杆菌作为表达系统的突出优势是制备简单、成本低廉，但作为革兰氏阴性细菌，大肠杆菌细胞壁内含脂多糖，为防止接种者发烧，疫苗制备过程中脂多糖含量的控制流程会增加提炼工艺的难度。另外大肠杆菌内培养的抗原多以沉淀（包涵体）形式存在，这也会增加后期纯化工艺的难度；如果需对抗原进行接近人体细胞的糖基化修饰，则野生型原核细胞系无能为力。因此我们会不断通过基因优化来丰富大肠杆菌表达系统的功能，目前在改造低致热源菌种、改善抗原可溶性表达方面已取得初步进展，目标是将大肠杆菌类病毒颗粒疫苗技术平台打造成全球独特、功能最为丰富的疫苗研制技术平台，用以研制更为复杂的疫苗。
另外，除了我们专攻多年的基因工程疫苗，我们也积极尝试其他技术制备高科技疫苗。水痘-带状疱疹病毒不仅会导致儿感染患水痘，该病毒在患病者体内还可能潜伏至老年阶段表现为带状疱疹，而且这两种疾病的发病率在普通人群中都比较高。目前国内普遍采用的减毒活疫苗如果只采用一针接种，很多儿童日后仍可能感染轻症水痘，更重要的是此类疫苗并不能防止接种者在晚年患带状疱疹。我们在前期研究中首先发现水痘-带状疱病毒ORF7基因是感染皮肤和神经的双毒力决定因子；利用反向遗传学技术，我们已经研发出全球首创的ORF7基因缺陷型减毒水痘活疫苗，并在2017年11月已获临床试验批件。
▲水痘-带状疱疹病毒感染人体的过程（图片来源：《Nature Reviews》）
艾滋病毒显像之路，科学“椭圆”的真理探索
·除了疫苗，您团队在艾滋病毒等病原体检测领域也获得了重要的成果。请您介绍一下相关产品的研发历程。
夏宁邵教授：我们在2004年推出了世界上首个高致病性禽流感快速诊断试剂盒，另外我们多年来重点关注艾滋病毒检测。艾滋病、结核病、疟疾被誉为新世纪三大传染病，其防治计划也被写入联合国《千年宣言》中的《千年发展目标》，这其中艾滋病的防治挑战最为严峻，而艾滋病诊断方法至今依然有许多提升空间。在艾滋病毒诊断试剂的国产化、优质化、系列化方面，我们的团队始终扮演着引领者的角色。
1999年，我们研制出中国首个可产业化的高活性HIV抗原，2000年研制出我国首个第三代艾滋抗体诊断试剂，引领了国产艾滋诊断试剂的全面换代。之后我们还陆续推出了快速检测试剂、第四代艾滋抗原抗体检测试剂，并且研制出重组免疫印迹法确证试剂、国内首个高灵敏度HIV核酸定量检测试剂。另外，因为在大样本人群中进行血检或核酸检测成本过高以及检测便捷性的问题，所以我们也针对抗原较少的体液样本开发了高灵敏度快速测试，2011年我们推出了唾液艾滋病毒无创快速检测试剂，应用于医疗机构大规模初筛和恐艾人群实时自查。
·您早年曾经从事过临床工作，而今则已多年深耕于医疗产品的研发多年。几乎每一个疫苗的研发过程都跨越十年以上，多年的研究历程中有哪些心得感触？
夏宁邵教授：从单枪匹马初创团队到现在，我们中心的研究人员已经超过200人，建立了从基础研究到应用研究的完整创新链条，覆盖基因工程疫苗、体外诊断、工程抗体、乙肝研究、肿瘤治疗、流感研究、基础病毒学、动物模型、流行病学与临床评价等多个研究方向。也许有人认为我们总能把握住前沿方向，但我们现有的成果依靠的不是天赋，而是耐心与毅力。
创新之路有许多种选择方向，但我们选择的每个项目都是持久战，支撑我们的精神信仰正是为民众谋求健康福祉的理想，以及对病毒免疫之路的不竭探索。我们中心大楼名叫椭圆楼，其古典优雅又饱含哲思的铭文，正是所有科研创新者的心声：“千里之行始于足下，九层之台起于累土，科学探索源于一‘点’，代有群贤，开拓损益，日久乃仿佛为圆；由椭而圆，由圆而椭，生生不息，渐臻于真理。”我们希望在这个继往开来的好时代，为大健康事业做出更大的贡献。
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