Cell：开发出低成本的基于CRISPR/Cas9的纸片诊断系统快速检测寨卡病毒

在一项新的研究中，一个由多个机构组成的由美国哈佛大学维斯生物启发工程研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering）合成生物学家James Collins博士领导的国际小组开发出一种低成本的基于试纸的快速诊断系统，该系统能够毒株特异性地检测寨卡病毒（Zika virus, ZIKV），而且它可能很快被用来在现场筛查血液、尿液或唾液样品。相关研究结果于2016年5月6日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components”。Collins是这篇论文的通信作者。

基于Collins和他的研究团队之前的研究，Collins团队与来自美国麻省理工学院、布罗德研究所、哈佛医学院、亚利桑那州立大学、威斯康星大学麦迪逊分校、波士顿大学、康奈尔大学、加拿大多伦多大学和Addgene公司的研究人员合作，在6周时间内开发出这种快速诊断测试系统原型，并且描述了他们的检测方法。

在埃博拉健康危机期间出现的技术创新

2014年10月，Collins团队开发出一种突破性方法将合成基因网络---能够作为可编程的诊断模块和传感器---嵌入在可随身携带的由普通试纸制作成的小型纸片（paper disc, 也译作纸盘）上。

受到非洲当时正在发生的埃博拉病毒爆发的触动，Collins团队证实一种概念验证的可改变颜色的诊断模块通过嵌入到纸上后，形成一种旨在筛选特异性RNA序列的合成生物分子传感器，从而能够用来筛选埃博拉病毒。这些特异性RNA序列不仅能够标记埃博拉病毒的遗传特征序列，而且能够标记包括寨卡病毒（ZIKV）、SARS冠状病毒、麻疹病毒、流感病毒、丙肝病毒和西尼罗河病毒在内的其他RNA病毒的遗传特征序列。Collins团队认为，这种方法有朝一日能够用于在现场鉴定血液、尿液或唾液样品中的病毒。

然而，在此之前，Collins团队的这种基于纸片的诊断技术不能有效地检测在血液、尿液和唾液中通常发现的极低浓度的病毒。如今，利用来自感染上ZIKV的猴子的血液和从实验室中被ZIKV感染的细胞中回收到的这种病毒，该团队验证了一种克服了这个问题的下一代诊断系统。

在寨卡病毒爆发的催促下，基于纸片的诊断工具取得进展

论文共同第一作者、多伦多大学莱斯利丹药学院助理教授Keith Pardee博士说，“新闻中来自正在发生的寨卡病毒危机中的生动画面是令人揪心的。我们希望诸如这种诊断系统之类的工具能够有助在疫苗开发出来前降低ZIKV爆发的影响。”

考虑到现场使用，Collins团队设计一种简单的模块化工作流程，由三个步骤组成：扩增、寨卡病毒检测和CRISPR-Cas9辅助的毒株鉴别。作为一种源自细菌免疫系统的基因编辑机制，CRISPR-Cas9能够被用来寻找整个基因组序列，以便发现独特的遗传特征序列。利用CRISPR-Cas9优异的序列识别能力，这种诊断系统的第三部分就是CRISPR-Cas9辅助的基于纸片的诊断模块以便区别不同的遗传特征序列最少只相差一个核苷酸的毒株。

一旦样品中的RNA通过使用酶和引物的混合物进行扩增后，将一滴扩增产物溶液加入到冻干的含有细胞组分和生物蛋白的纸片上。含有扩增RNA的这滴溶液激活冻干的组分以至于纸片改变颜色，从而指示ZIKV阳性结果。尽管这种结果的肉眼读取方式类似于早孕测试纸，但是一种经过特殊设计的电子阅读器也能够被用来更快地获得结果，而且有朝一日可能能够被用来定量检测样品中的病毒载量。

如果检测到ZIKV，那么第三步涉及将样品与冻干的CRISPR-Cas9混合在一起，然后利用这种混合液润湿另一组可改变颜色的纸片。依赖于样品中含有的ZIKV毒株，这些纸片经历另一系列肉眼可观察到的颜色变化。尽管合成生物学家和遗传工程学家通常将CRISPR-Cas9放入在活细胞内发挥功能，但是Collins团队发现当在体外冻存时，它也能够发挥功能，而且在一些情形下甚至具有更好的功能。

论文共同第一作者、亚利桑那州立大学生物设计研究所分子设计与生物仿生学中心助理教授Alexander Green博士说，“我们利用我们的诊断系统测试了与ZIKV亲缘关系比较接近的登革热病毒毒株，结果发现在头两个步骤中，我们的系统就能够轻松地区分ZIKV和登革热病毒。加入基于CRISPR-Cas9的第三个步骤---首次在基于纸片的平台上使用Cas9---只是增强检测准确性。当我们准备将这种技术进行临床转化时，我们计划利用几十种或甚至上百种临床样品来验证我们的诊断系统。”

抵抗未来的流行病

这种诊断系统中的所有组分能够在冻干后进行储存和运输，同时保持它们的功能。能够在现场准确地进行毒株特异性地诊断可能对实时追踪病毒流行病扩散和制定遏制策略与治疗计划的国家和全球卫生机构而言是非常有价值的。

Collins团队开发出的这种诊断系统可能能够经过调整后用来鉴定许多种病原体，而且考虑到这种诊断系统的基于纸片的性质，它是一种极具成本效益的诊断平台。更重要的是，这种诊断方法是稳健的，而且在面临新出现的流行病爆发时，人们可以利用它快速作出反应，和开发出新的诊断方法。这种廉价的诊断系统在健康和环境筛查（特别是在资源条件比较差的地区）中的应用潜力是巨大的。

原始出处：

Keith Pardee14, Alexander A. Green14,et al,Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components,cell,2016,doi:10.1016/j.cell.2016.04.059