Dev Cell：哌柏西利显著提高神经母细胞瘤分化，有望改善现有疗法

神经母细胞瘤是婴儿最常见的颅外实体瘤，由发育停滞的神经嵴源性细胞引起，占儿童癌症死亡人数的15%。驱动肿瘤分化是一种很有希望的治疗方法。分化治疗在儿童急性前髓细胞白血病中看到了前景，治疗方案中引入分化诱导剂全反式维甲酸（RA）显著提高了完全缓解率。

细胞周期蛋白D-CDK4/6在神经母细胞瘤中广泛过表达，使其成为特别有吸引力的治疗靶点。CDK4/6抑制剂帕博西尼被批准用于乳腺癌治疗，已证明帕博西尼可诱导神经母细胞瘤的G1停滞。先前的研究表明CDK抑制剂可以抑制神经母细胞瘤的增殖,但尚未系统研究CDK抑制剂是否可以诱导神经母细胞瘤细胞分化。

近日，剑桥大学干细胞研究所 Anna Philpott 教授团队在 Developmental Cell 上发表题为 Palbociclib releases the latent differentiation capacity of neuroblastoma cells 的文章。该研究发现哌柏西利不仅可以抑制神经母细胞瘤细胞的增殖，还可以促进广泛的神经元分化，该研究显示哌柏西利可显著提高神经母细胞瘤分化疗效，或许可以与维甲酸联合使用来改善患者预后。

哌柏西利抑制神经母细胞瘤细胞增殖，且促进细胞分化

团队首先研究CDK4/6抑制剂帕博西尼（PB）对3个肾上腺素能神经母细胞瘤细胞系的影响，结果如预期，PB处理5天后细胞增殖明显减少。还发现，PB处理后出现神经元分化的一致特征，即神经突生长和细胞聚集（图1E-G），神经突长度和分支点增加（图S1B），且其促分化作用仅限于肾上腺素能神经母细胞瘤模型。总之，PB不仅如预期的那样驱动细胞周期退出，而且还诱导肾上腺素能神经母细胞瘤细胞的神经元分化。

图1. 帕博西尼驱动肾上腺素能性神经母细胞瘤细胞的细胞周期退出和分化

哌柏西利激活神经元分化转录程序

3个细胞系用PB处理短时间或长时间，收集RNA进行RNA测序（图S2A）。基因分析显示，细胞周期相关基因早期下调，剪接体逐渐下调，随后线粒体成分下调（图2A和B）。还观察到质膜和离子通道复合物的早期上调，随后是突触和轴突成分的上调，表明分化。总之，这些数据显示了帕博西尼对转录组的强大重编程作用，在3种神经母细胞瘤中都减少增殖，诱导神经元分化。

图2.哌柏西利驱动与神经母细胞瘤分化相关的转录变化

哌柏西利重塑了与分化一致的表观遗传景观

对长时间PB处理的3个细胞系进行H3K27ac ChIP-seq（图S3A），观察到广泛的形态分化。基因分析显示，PB处理导致与神经元发育生物学过程相关基因近端H3K27ac沉积持续增加(图3B)，与RNAseq观察到的变化一致(图2)。H3K27ac标记减少近端基因与其他发育途径相关，包括腺体、肾上皮和间质发育(图3C)。总之，PB处理重组了神经母细胞瘤细胞的表观遗传景观，有利于神经元分化和轴突发生，并限制了其他发育途径。

图3. 哌柏西利重组表观遗传景观以支持分化

哌柏西利在小鼠神经母细胞瘤模型中抑制肿瘤生长

使用Th-MYCN基因工程小鼠模型，其反映了高风险MYCN驱动的神经母细胞瘤的许多临床特征。结果，40 mg/kg的帕博西尼足以抑制肿瘤生长(图4A和4B)，且该剂量耐受性良好(图4C)，该剂量的治疗具有显著的生存获益(图4D)。又使用了移植了人类神经母细胞瘤细胞IMR-32的免疫功能低下小鼠测试PB，发现PB也能有效抑制肿瘤生长(图4E和4F)。这些结果表明：PB能够在体内抑制神经母细胞瘤的生长，是一种有效且耐受的细胞抑制剂。

图4. 哌柏西利在体内神经母细胞瘤小鼠模型中抑制肿瘤生长

哌柏西利和维甲酸共同抑制神经母细胞瘤细胞的增殖

虽然单独的PB治疗可以显著地重新激活神经母细胞瘤细胞的分化程序，但不能实现完全的细胞周期阻滞，因此联合治疗可能会提供进一步的益处。使用PB (1 mM)、RA (10 mM)或两药联合处理神经母细胞瘤细胞。Ki67免疫细胞化学、EdU掺入分析和CellTiter-Glo细胞活力测定都表明，与单独使用PB相比，PB +RA处理的细胞中循环细胞显著减少(图5H-5K)。PB和PB + RA还增加了神经元标记物STMN4和STMN2的表达，这与活细胞成像显示的形态学变化相吻合(图S4I及S4J)。这些结果表明与单独使用PB相比，PB + RA进一步抑制细胞循环，表明两药联合治疗的潜在益处。

图5. 哌柏西利和维甲酸共同抑制神经母细胞瘤细胞的增殖

哌柏西利和维甲酸促进全基因组的变化，有利于减少增殖和增强分化

对PB、RA或PB + RA处理5天的神经母细胞瘤细胞进行了RNA-seq分析和H3K27ac ChIP-seq分析(图S5A和S5B)，观察到一组基因只有在PB + RA联合治疗后才会大幅上调(簇4，图6C)，这些基因与神经元细胞体以及细胞外基质细胞成分相关(图6D)，与增强分化一致。PB上调了另一个基因子集，并通过PB + RA联合治疗进一步上调(簇5，图6C);它们与突触囊泡、突触膜和其他与神经元发育相关的成分有关(图6D)。

结果表明，PB和RA都改变了与神经元分化相关的基因周围的表观遗传景观，并且通过相加作用和药物特异性调节，两药可能在联合使用时增强这些变化。

PB + RA治疗促进有利于患者生存的转录特征

评估PB + RA反应中发生的转录变化如何指向这种治疗对患者生存的潜在益处。利用R2 Genomics平台的数据，确定了两组与神经母细胞瘤患者生存率低显著正相关和负相关的基因。然后，观察PB + RA联合处理神经母细胞瘤细胞后这些基因组的表达变化。引人注目的是，高表达与患者生存差相关的基因被PB + RA强烈下调，而低表达与生存差相关的基因被显著上调(图7A)。因此，PB + RA能够驱动转录程序，这可能对患者非常有益。

PB + RA协同抑制肿瘤生长，诱导肿瘤球体分化

最后，在更复杂的临床相关培养系统中验证上述结果，研究了PB和RA对肿瘤球体的影响。结果发现，PB和PB + RA处理抑制了3个神经母细胞瘤细胞系的球体生长(图7C, 7D和S6A-S6D)。PB和PB + RA处理使细胞形态发生变化，神经突延长，神经元标记物TUBB3表达上调(图7E、S6E和S6F)。PB或PB + RA可下调增殖标志物，上调神经元分化标志物(图7F、7G和S6G-S6J)。RA单独作用有限，而PB + RA比PB单独作用更能减小肿瘤球体大小，降低增殖标志物表达，增加分化标志物表达。总之，在RA中添加PB作为联合治疗，或在RA反应性低的肿瘤中单独使用PB，都可以显著提高神经母细胞瘤分化治疗的临床益处。

图6. PB + RA促进全基因组的变化，有利于减少增殖和增强分化

总结：

本研究系统阐明了CDK4/6抑制剂帕博西利单药或与维甲酸联合用药治疗神经母细胞瘤的巨大潜力,研究设计和技术方法齐全。但仍有一些可改进之处:

1)仅测试了3个细胞系,更大范围不同基因背景的细胞系还需要验证。

2)体内小鼠模型仅测试了帕博西利单药,维甲酸联合用药的抗肿瘤活性和协同作用有待进一步验证。

3)肿瘤球体实验时间点仅为7天,长时间点可能更能观察到维甲酸的疗效。

4)临床前后续研究还需在患者样本中验证研究结论。

总之，本研究为帕博西利单药或与维甲酸联合用药治疗神经母细胞瘤奠定了坚实的基础,后续研究可在更大样本量和体内模型中深入优化联合用药方案,以推进临床转化研究。

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