１６例中途胚胎植入前遗传学诊断／筛查病例报道

胚胎植入前遗传学诊断／筛查（ ＰＧＤ／ＰＧＳ）是在 体外受精胚胎移植（ ＩＶＦ－ＥＴ）过程中，对形态学可用 的胚胎进一步进行种植前活检和遗传学分析，选择 无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿 的诊断方法，其适应证包括染色体异常、单基因病、 不明原因复发性自然流产、反复种植失败、高龄等。 目前，许多生殖中心在实施ＩＶＦ－ＥＴ时并未将染色 体核型分析列为常规术前检测项目，有的不孕患者 最初没有ＰＧＤ／ＰＧＳ指征，在接受常规ＩＶＦ助孕后 产生了新的诊断，又符合ＰＧＤ／ＰＧＳ指征，进而要求 对剩余冻存的胚胎进行ＰＧＤ／ＰＧＳ。如果我们把从 开始计划实施的 ＰＧＤ／ＰＧＳ称为计划 ＰＧＤ／ＰＧＳ， 则可以把这种中途突发进行的ＰＧＤ／ＰＧＳ称为中途 ＰＧＤ／ＰＧＳ（Ｍｉｄｗａｙ　ＰＧＤ／ＰＧＳ）。本文通过对１例 Ｍｉｄｗａｙ　ＰＧＤ／ＰＧＳ过程详细报道，结合其他１５例 相似病例的治疗结局，复习文献，分析中途 ＰＧＤ／ ＰＧＳ与计划 ＰＧＤ／ＰＧＳ操作的不同之处及对结局 的可能影响，以期为今后临床实践提供参考。

患者２８岁女性，既往早孕人流１次，不孕２年，造影提示双侧输卵管阻塞，男方精液化验正常。于 ２０１７年１月来西北妇女儿童医院生殖中心接受 ＩＶＦ－ＥＴ治疗。采用经典长方案，黄体中期起予短 效曲普瑞林（ ＧｎＲＨ－ａ，达必佳，辉凌，德国） ０．１ｍｇ 进行垂体降调节，达降调效果后每天加用基因重组 人ＦＳＨ（ｒＦＳＨ，果纳芬，默克雪兰诺，瑞士） １５０Ｕ促 排。当３个以上卵泡直径≥１８ｍｍ 时，注射 ＨＣＧ （珠海丽珠） １０　０００Ｕ 诱导排卵， ３６ｈ后采卵，取卵 当天起给予黄体酮６０ｍｇ／ｄ肌肉注射。获卵１８枚， 常规ＩＶＦ受精， ２ＰＮ　１４个，序贯培养至 Ｄ５，共形成 ７个可用囊胚（依据 Ｇａｒｎｄｅｒ囊胚分级法）。移植一 枚囊胚（ ４ＢＢ）后剩余６枚囊胚行玻璃化冷冻。移植 后继续黄体酮 ６０ ｍｇ肌肉注射， １２ｄ 后测血清 ＨＣＧ　６８８Ｕ／Ｌ，移植后２８ｄＢ超提示宫内单活胎， 移植后５２ｄＢ超提示胚胎停育，行清宫术。术后３ 个月后再次解冻移植（ ＦＥＴ） ２枚囊胚（ ４ＢＢ、４ＢＣ），结局仍为单胎孕早期自然流产。２次流产物均未送 遗传检测。 对夫妇双方进一步做复发性流产（ ＲＳＡ）相关 检查，包括双方染色体核型分析、女方血浆 Ｄ－２聚 体、血同型半胱氨酸、血小板聚集度、抗凝血酶Ⅲ活 性、抗心磷脂抗体、抗糖β ２蛋白抗体、抗核抗体、抗 ｄｓＤＮＡ、淋巴细胞亚群、蛋白Ｓ、蛋白 Ｃ。发现男方 染色体核型为４６，ＸＹ， ｔ（ ５；１３）（ ｑ２２； ｑ２２），其他检 测结果未见异常。该夫妇进行遗传咨询时被告知： 男方为平衡的相互易位携带者，子代理论上有１／１８ 几率染色体完全正常、 １／１８几率为相互平衡易位携 带者，其余几率为染色体不平衡，后者有发生胚胎种 植失败、流产、死胎、畸形等不良结局可能。夫妇双 方来生殖中心要求对剩余囊胚进行植入前遗传学检 测。签署知情同意书后对４枚冷冻囊胚解冻复苏、 透明带打孔、活检，活检后囊胚再次玻璃化冷冻。我 院遗传中心对活检细胞进行全基因组扩增、采用微 阵列比较基因组杂交方法（ ａ ｒｒａｙ －ＣＧＨ，Ａｇｉｌｅｎｔ平 台）行遗传学检测。结果回报２个为整倍体囊胚、２个为非整倍体囊胚。人工周期准备内膜，选择１ 个整倍体囊胚进行ＦＥＴ，常规黄体支持用药，移植 后１２ｄ测血清 ＨＣＧ　２２４Ｕ／Ｌ，移植后２８ｄＢ超示 宫内单胎存活，孕３９周剖宫产一男婴，体重３　 ０００ｇ， 发育正常。

Ｍｉｄｗａｙ　ＰＧＤ／ＰＧＳ 我院近年来共完成１６例 Ｍｉｄｗａｙ　ＰＧＤ／ＰＧＳ 检测，其中７例是因为后发生的ＲＳＡ 诊断， ６例为 不良孕史（包括流产物微缺失微重复检测异常１例、 胎儿多发畸形引产２例、胎儿／出生儿２１三体３ 例）， ３例为迟检测到的染色体核型异常。共活检了 ５７个冷冻复苏囊胚，均采用ａｒｒａｙ －ＣＧＨ 方法检测。 结果非整倍体胚胎３１个、整倍体胚胎２４个、无信号 胚胎２个，可用胚胎率为４２．１％。１１人有可用囊 胚，其中１０人共ＦＥＴ　１３周期，结果６周期未孕、 １ 周期自然流产、 ４周期继续妊娠随访中， ２周期足月 产（表１）。可用胚胎率和临床妊娠率均相似于我中 心同期计划ＰＧＤ／ＰＧＳ（分别为４２．１％ ｖｓ．２８．５７％， ５３．８％ｖｓ．５７．３８％） ［ １］。

计划ＰＧＤ／ＰＧＳ在胚胎实验室的流程为：取卵→ ＩＣＳＩ受精→Ｄ３胚胎期打孔→Ｄ５囊胚活检→囊胚 冷冻 → 对回报可用囊胚择期行解冻移植。而在 Ｍｉｄｗａｙ　ＰＧＤ／ＰＧＳ，实验室流程被动变为取卵→ ＩＶＦ受精→囊胚冷冻→囊胚解冻复苏→囊胚打孔、 活检→再次囊胚冷冻→对回报可用囊胚择期再次行 解冻移植。那么以下问题就需要探讨：（ １）ＰＧＤ／ ＰＧＳ能否采取ＩＶＦ受精？（ ２）囊胚期打孔是否可 行？（ ３）反复冻融对胚胎发育有无影响？为此我们 复习了多项ＰＧＤ／ＰＧＳ指南，包括２００４年ＰＧＤ国 际协会颁布的 ＰＧＤ 技术指南及于２００８年修正的 ＰＧＤ操作流程及实验室质量保障指南［ ２］、欧洲人类 生殖与胚胎协会（ ＥＳＨＲＥ）ＰＧＤ联盟就 ＰＧＤ实验 室的设立及相关的３项技术———ＤＮＡ扩增技术、荧 光原位杂交（ ＦＩＳＨ）技术和胚胎活检———建立的相 关指南［ ３ －５］、 ２０１５ 年 Ｔｕｒ －Ｋａｓｐａ 等［ ６］提出的用于 ＨＬＡ配型的 ＰＧＤ 指南及 Ｇｉｒａｒｄｅｔ等［ ７］２０１６年提 出的囊性纤维瘤ＰＧＤ指南、加拿大妇产科医生协会 ２０１５年发布的胚胎植入前基因诊断和筛查技术指 南［ ８］，以及其他相关文献，以期回答上述问题。 １．ＰＧＳ／ＰＧＤ 受精采用ＩＣＳＩ还是ＩＶＦ：选择 ＩＣＳＩ的理由包括：（ １）增加２ＰＮ率，提高卵子利用效 率；（ ２）避免精子来源的污染。因此目前所有指南对 包含ＰＣＲ步骤的ＰＧＳ／ＰＧＤ均推荐使用ＩＣＳＩ，目的 即是减少来自黏附于囊胚透明带的父系精子 ＤＮＡ 污染；荧光原位杂交（ ＦＩＳＨ）则ＩＶＦ和ＩＣＳＩ受精两 者均可［ ５， ９］。进一步细分，所有ＰＧＤ中授精步骤均 推荐使用ＩＣＳＩ而非常规授精［ ４， １０］；而对于 ＰＧＳ，目 前美国 ＣｏｏｐｅｒＧｅｎｏｍｉｃｓ公司采用ＩＶＦ受精，并将 此写入其认证的操作流程。他们的依据在于，对多 达５０条的精子进行扩增后并无 ＤＮＡ产物，因此无 需担心粘附于透明带上的精子污染。但对ＰＧＤ病 例仍要求采用ＩＣＳＩ授精，尤其是采用短串联重复序 列多态性连锁分析（ ＳＴＲ－ＰＣＲ）扩增进行单基因 ＰＧＤ时，因为细胞裂解过程可放大精子物质。由于 所用扩增方法不同，导致精子 ＤＮＡ 扩增程度也不 同，因此采用何种受精方式建议参考各实验室流程、 单细胞扩增技术和验证流程。此外，还需要关注另 一种污染，即卵丘细胞污染。有一例胚胎ＰＧＤ诊断 结果为４６，ＸＸ，但新生儿出生为４６，ＸＹ，其 ＤＮＡ指 纹显示为母体来源。推测原因可能是把一团粘附的 滤泡细胞误认为是脱出的滋养层细胞进行了“活检”。

不管采用哪种受精方法都有发生这种污染的可能，因 此操作人员在活检过程中仔细识别活检材料非常 重要。 ２．解冻囊胚打孔（ ｚ ｏｎａ　ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）：针对囊胚 期活检，指南中推荐在胚胎期打孔、在囊胚期对从孔 中突出的滋养外胚层细胞进行活检［ １］。但也有缺 点：若后期形成的内细胞团位于打孔处，则活检操作 可能损伤已分化的内细胞，影 响 后 续 胚 胎 发 育［ １１ －１３］；效率低———打孔的胚胎不一定都能发育成 囊胚。也有文献尝试在囊胚期打孔［ １４］。相较卵裂 期打孔，囊胚期打孔优点在于：（ １）打孔位置可选择， 可避开内细胞团附着处；（ ２）避免对囊胚发育过程的 干扰。但该方法需要先对囊胚进行皱缩、等到囊胚 再次复张并孵出才能活检，部分情况下当天是无法 完成活检。本研究中为解冻囊胚，操作时可以选择 合适时机，即在囊胚解冻后尚有一定程度皱缩状态 下、选取远离内细胞团处、透明带薄、且和滋养外胚 层有一定间隙处打孔，然后放置培养箱孵育，待有滋 养外胚层细胞从打孔处突出时取活检，则可以最大 限度避免对滋养外胚层细胞的损伤。 ３．反复冻融对胚胎发育的影响：冷冻技术是 ＰＧＤ／ＰＧＳ过程中一项重要步骤，为囊胚活检后的 遗传检测赢得了时间。目前采用的玻璃化冷冻技术 经２０多年的发展，目前已广泛用于人类卵母细胞、 原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的冷冻，获得了较高 的解冻复苏率，很多文献报道冻融胚胎和冻融囊胚 移植是可行和安全的［ １５ －１７］。但目前尚缺乏对玻璃 化胚胎出生婴儿终生随访的全面资料，胚胎反复冻 融其临床有效性、安全性更需人们关注。临床工作 中胚胎反复冻融大都为特殊情况下的非常态操作， 相关的研究较少。２０１５年的一项研究显示，重复冷 冻组的胚胎种植率、临床妊娠率比单次冷冻组 低［ １８］；最新的一篇文献也显示反复冻融组自然流产 率高于对照组而活产率低于对照组［ １９］。二次冻融 影响妊娠结局可能与多个因素相关。首先，多次玻 璃化冷冻过程中使用较高浓度的冷冻保护剂可使细 胞发生毒性效应和渗透性休克。现普遍认为，乙二 醇是人胚胎、受精卵、卵母细胞玻璃化冷冻最有效的 低毒性冷冻保护剂，冻融后存活率高，但其与胚胎接 触时间过长（＞２ｍｉｎ）、温度过高（＞２５℃）时，其细 胞毒性作用增强。其次，尽管认为玻璃化冷冻中极 少有胞内冰晶形成，但当预平衡或暴露于玻璃化溶 液中时间过短时，会发生细胞脱水和冷冻保护剂置换不充分，此时会产生胞内冰晶，对细胞造成损伤。 反复冷冻情况下这些不良事件发生概率增加、不利 影响累加，最终可能影响到胚胎发育潜能。这就要 求胚胎学家操作严格按照流程进行，同时也要求我 们工作中尽可能个体化处理、准确预判，任何情况下 都要尽可能避免对胚胎反复冻融。 总之，中途行 ＰＧＤ／ＰＧＳ与计划行 ＰＧＤ／ＰＧＳ 在操作程序有诸多不同，现有指南未涉及，目前无指 导性建议。其中ＩＶＦ 受精、反复冻融有可能影响 ＰＧＤ准确率和胚胎进一步发育潜能，如何评价其效 果有待进一步积累经验。

参考文献略。

原始出处：

柏海燕, 师娟子. 16例中途胚胎植入前遗传学诊断/筛查病例报道及文献复习[J]. 生殖医学杂志, 2018, 27(10):104-107.