化繁为简 -- 检测p16/Ki-67双染，HPV分型是否还需要？

关键信息

■ p16/Ki-67双染是检测HPV持续感染导致细胞周期失调的标志，和宫颈病变的严重程度密切相关，不受HPV不同亚型的影响。

■ HPV检测的是感染的病因，不同亚型风险不同；但p16/Ki-67双染检测的是任何HPV亚型持续感染的结果。

■ HPV不同亚型感染，都有大量一过性，即便是风险最高的HPV16,18阳性，其中75%是NILM或CIN1，FDA批准，HPV16,18阳性，也可以进一步用p16/Ki-67双染指导临床管理。

2021年，WHO发布《子宫颈癌癌前病变筛查和治疗指南(第2版)》，HPV单独初筛在全球被越来越多的国家所推荐，同时，HPV 初筛阳性后，细胞学作为分流技术，敏感性不够，导致相当数量的病变不能被第一时间发现；各种新的分流技术，包括p16/Ki-67双染，拓展分型和甲基化等新技术成为临床研究的热点，其中p16/Ki-67双染从2011年开始，累计发表了400多篇研究，积累了充足的高质量的循证医学证据，包括基于健康人群的大样本前瞻性研究，横断面研究，以及有纵向随访1年、3年以及5年的长期随访临床研究。

WHO为下一步指南更新计划，制定了四个步骤，并明确了2个新的检测技术【1】，一个是HPV mRNA, 一个就是p16/Ki-67双染。

p16/Ki-67双染是检测HPV持续感染导致细胞周期失调的标志

p16INK4a蛋白在细胞周期进程中起到抗增殖作用，而Ki-67 是一种与细胞增殖密切相关的蛋白。正常细胞中，二者相互排斥，不能同时表达；但当HPV持续感染，E6/E7癌蛋白在细胞中高表达，导致细胞周期异常，两者才会同时表达。通过免疫细胞化学（ICC）同时检测同一细胞内的 p16 和Ki-67 已被证明可以在细胞学制备样本中识别非典型增生的宫颈细胞，而无需进行形态学解读。一项三年的队列研究显示“p16/Ki-67共表达与HR-HPV持续感染密切相关，尤其是HPV16/18型，以及CIN2+病变的存在”【2】。

图一 p16/Ki-67 双染的检测原理

p16/Ki-67双染检测和病变的严重程度密切相关，不受HPV不同亚型的影响。

p16/Ki-67双染是宿主细胞的标志物，检测的是包括所有亚型持续感染所导致的细胞周期失调。虽然不同HPV亚型的致病性不同，但p16/Ki-67双染的阳性率，随着宫颈病变的严重程度升高而升高，这个趋势，在不同HPV亚型导致的病变中，都是一致的【3，4】。

图二 IMPACT 研究 p16/Ki-67双染在不同HPV亚型不同宫颈病变的相关性【3】

HPV检测的是感染的病因，p16/Ki-67双染检测的是HPV持续感染的结果

从感染的病因学维度，通过HPV分型来风险分层，重点关注HPV31/33/52/58风险高的亚型，会忽略一些低风险的HPV亚型所会导致的CIN2+。其次，一次HPV分型检测，无法判断是否是持续感染，导致了相当数量的延误诊断。另外，HPV通常感染的时间是2-3年，对某些亚型缩短随访周期积极管理，虽然能提前诊断疾病，但同时也会导致大量一过性感染被误判为持续感染，增加了大量不必要的阴道镜转诊数量。

从持续感染的结果这一维度，通过p16/Ki-67双染检测进行风险分层，是一种更简单和直接的方式：p16/Ki-67双染检测的是包括各个HPV亚型的持续感染导致的结果，不用考虑不同亚型的影响；对原本需要随访的人群（其他12亚型阳性，细胞学NILM）用双染分流，可以提前发现69%的CIN2+【3】，从而减少随访，减少延误诊断。

HPV 16,18阳性，也能用p16/Ki-67双染进行分流管理

一项美国北加州凯撒医疗机构（KPNC）的3年随访研究显示【5】，HPV16,18阳性，无论细胞学是异常（ASC-US+）还是正常（NILM），风险都高于这个研究中的阴道镜转诊阈值（HPV阳性，细胞学ASC-US的风险），再次证明：如果基于HPV+细胞学的筛查策略，HPV16,18阳性，都应该直接转诊阴道镜。但是，如果用p16/Ki-67双染分流，HPV16,18阳性、双染阴性的风险低于阴道镜转诊阈值，可以进行随访。从而说明，如果基于HPV+p16/Ki-67双染的筛查策略，HPV16,18阳性可以根据双染的结果，采取不同的临床管理方案。

图三 HPV16,18, 细胞学和双染的CIN3+风险

2020年美国FDA批准，针对HPV16,18亚型阳性，结合受检者既往筛查史，及其他危险因素和指南，可以用罗氏公司CINtec:registered: PLUS Cytology test（p16/Ki-67双染检测）进一步指导患者管理【6】。

基于p16/Ki-67双染的宫颈癌筛查策略，显著优于基于细胞学的筛查策略

IMPACT研究【3】是CINtec PLUS的一项多中心前瞻性FDA注册研究，纳入了美国32个采样点的35,263名女性，包括了不同种族以及疫苗接种和没有接种的人群，头对头比较了四种初筛+分流的策略，评估筛查的益处（CIN2+/CIN3+敏感性）和筛查的危害（每一例病变所需阴道镜数量）：

①HPV（不分型）阳性→细胞学分流

②HPV 16/18 阳性→阴道镜 + 其他12 HR-HPV亚型阳性→细胞学分流

③HPV（不分型）阳性→双染分流

④HPV 16/18 阳性→阴道镜 + 其他12 HR-HPV亚型阳性→双染分流

结果显示：

• 敏感性方面，两种双染的策略都优于两种细胞学的策略。

• 策略④ “HPV 16/18 阳性→阴道镜 + 其他12 HR-HPV亚型阳性→双染分流” 具有最好的敏感性（④比②CIN3+敏感性增加了9%）。

• 策略③“HPV（不分型）阳性→双染分流”，具有最佳的益处危害平衡性（③比②，CIN3+敏感性增加了3.5%，且每一例病变所需阴道镜数量下降了16.3%）。

HPV阳性，双染阴性，安全性更高，随访周期可以延长到3年

来自KPNC的另一项前瞻性队列研究，5年随访数据显示【5】，对于CIN2+和CIN3+的5年累积风险值，双染阳性的风险始终高于细胞学异常（ASC-US+），而双染阴性的风险始终低于细胞学正常（NLIM）。此外，双染阴性的女性，CIN2+和CIN3+的3年累积风险值（红色圈）和指南推荐的一年随访的风险阈值（HPV阳性细胞学NILM风险值）相近，因此，对于HPV阳性p16/Ki-67双染阴性的女性，随访周期可以安全地延长到3年。

结语

p16/Ki-67双染，检测的是包括所有HR-HPV亚型的持续感染导致的细胞周期异常（结果），p16/Ki-67双染为宫颈癌筛查策略，提供了一种更加简单、安全且性能更优的选择。 

参考文献：

【1】WHO guideline for screening and treatment of cervical pre-cancer lesions for cervical cancer prevention, second edition: use of mRNA tests for human papillomavirus (HPV)

【2】Yu LL, Guo HQ, Lei XQ, Qin Y, Wu ZN, Kang LN, Zhang X, Qiao YL, Chen W. p16/Ki-67 co-expression associates high risk human papillomavirus persistence and cervical histopathology: a 3-year cohort study in China. Oncotarget. 2016 Oct 4;7(40):64810-64819.

【3】Yu L, Chen X, Liu X, Fei L, Ma H, Tian T, Wang L, Chen S. Significance of Triple Detection of p16/ki-67 Dual-Staining, Liquid-Based Cytology and HR HPV Testing in Screening of Cervical Cancer: A Retrospective Study. Front Oncol. 2022 Jun 7;12:915418.

【4】Wright TC Jr, Stoler MH, Ranger-Moore J, Fang Q, Volkir P, Safaeian M, Ridder R. Clinical validation of p16/Ki-67 dual-stained cytology triage of HPV-positive women: Results from the IMPACT trial. Int J Cancer. 2022 Feb 1;150(3):461-471.

【5】Wentzensen N, Clarke MA, Bremer R, Poitras N, Tokugawa D, Goldhoff PE, Castle PE, Schiffman M, Kingery JD, Grewal KK, Locke A, Kinney W, Lorey TS. Clinical Evaluation of Human Papillomavirus Screening With p16/Ki-67 Dual Stain Triage in a Large Organized Cervical Cancer Screening Program. JAMA Intern Med. 2019 Jul 1;179(7):881-888.

【6】Clarke MA, Cheung LC, Castle PE, Schiffman M, Tokugawa D, Poitras N, Lorey T, Kinney W, Wentzensen N. Five-Year Risk of Cervical Precancer Following p16/Ki-67 Dual-Stain Triage of HPV-Positive Women. JAMA Oncol. 2019 Feb 1;5(2):181-186.