刘传聚教授，最新Nature，治疗骨关节炎!

骨关节炎（OA）是一种致残性的、逐渐发展的关节疾病，其主要特征是逐渐进行性的关节功能衰竭。尽管目前尚不清楚OA的主要原因是什么，但OA的病理生理过程通常涉及到关节软骨的破坏和失去正常的基质结构，这是维持关节功能所必需的抗压弹性的丧失。

研究表明，OA病变中的关节软骨细胞扮演着至关重要的角色。这些细胞作为生物力学和生化刺激的靶点，不仅受到外部环境的影响，同时也是调节关节软骨破坏的蛋白酶、细胞因子和介质的主要来源。虽然关节软骨的丧失是OA的主要表现之一，但患者最为突出的临床症状是疼痛。在OA的疼痛机制中，特殊的外周感觉神经元在关节组织中起着重要作用，而这些神经元表达特异性的钠离子通道（VGSCs），如Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9等，这些通道在调节外周疼痛信号传导中扮演重要角色。

虽然VGSCs通常被认为存在于可兴奋细胞中，但最新的研究表明它们也存在于一些非兴奋性细胞类型中，例如软骨细胞。然而，至今关于VGSCs在软骨细胞中的存在及其在OA疾病进程和疼痛中的作用尚不为人所知。

2024年1月3日，纽约大学医学院刘传聚教授和耶鲁医学院Stephen G. Waxman合作，通过RNA测序分析鉴定OA中不同表达的基因，发现了Nav1.7作为OA中关键的控钠通道，并证实人类OA软骨细胞表达功能性Nav1.7通道，密度为每平方微米0.1至0.15个通道，每个细胞350至525个通道。连续基因消除Nav1.7在小鼠模型中显示该通道在神经元中参与疼痛传导，而在软骨细胞中调节OA的进展。药理阻断Nav1.7使用选择性或临床泛Nav通道阻滞剂显著改善了结构性关节损伤，并降低了OA疼痛行为。机制研究显示Nav1.7阻滞剂调节细胞内Ca²⁺信号传导和软骨细胞分泌物，对软骨细胞生物学特性和OA发展产生影响。该研究成果以“Nav1.7 as a chondrocyte regulator and therapeutic target for osteoarthritis”为题，发表在Nature上。第一作者是纽约大学医学院的Wenyu Fu。

【OA软骨细胞Nav1.7电生理学】

在OA患者的软骨细胞中，Nav1.7的表达水平明显升高。通过分子分析、RT-PCR、蛋白水平分析以及组织学检测等多种方法，研究发现Nav1.7在OA软骨中的表达水平显著增加。这表明Nav1.7在软骨细胞中的表达与OA的发展和进展密切相关。

在控制条件下以及加入1微米TTX（可以阻断除Nav1.5、Nav1.8和Nav1.9外的所有Nav通道）的情况下，对-50mV、-30mV、-10mV和10mV测试脉冲的典型电流示踪。右侧显示的是经过TTX减去TTX-R（TTX-抗性）电流后得到的TTX-S（TTX-敏感）电流（图1a）。TTX-S电流显示出在-40mV阈值开始激活，0mV时具有最大峰值电流，并显示钠电流反转电位（Er）为-60.6±2.3mV（图1b）。使用电压为半最大激活（V1/2）= -14.2±0.8mV，斜率系数（k）= 6.1±0.2mV的Boltzmann方程对TTX-S电流的G/Gmax进行了拟合（图1c）。对TTX-S电流进行动力学分析显示，其失活时间常数随膜电压增加而逐渐减少，从-20mV时的3.3±0.8ms降至50mV时的0.3±0.1ms（图1d）。TTX-S电流的峰值出现时间从-20mV时的1.8±0.2ms逐渐减少至50mV时的0.5±0.1ms（图1e）。通过记录钠电流，在20纳米ProTx II应用前后进行比较。蓝色曲线显示了受ProTx II作用的电流（ProTx II-S），红色曲线显示了受1微米TTX作用的电流（图1f和g）。TTX-S和ProTx II-S电流峰值归一化后的重叠图显示了它们相似的时间特性（图1h）。比较了TTX-S和ProTx II-S电流的动力学参数，包括失活时间常数和峰值时间。结果显示两者之间没有显著差异（图1i）。对不同药物（TTX和ProTx II）对电流的影响进行了评估，显示Nav1.7对OA软骨细胞中的钠电流产生重要影响（图1j）。

这些结果表明Nav1.7在OA软骨细胞中的存在，并显示出与已知的Nav1.7类似的电生理特性和对ProTx II的抑制效果。通过记录77个OA患者的软骨细胞，结果表明约17%的细胞产生具有快速失活组分的内向钠电流。

图1 | OA软骨细胞中存在TTX-S电流，主要由Nav1.7 ProTx II-S通道产生。

【软骨细胞中Nav1.7的删除可免受OA影响】

在实验中删除软骨细胞和DRG神经元中的Nav1.7明显减轻了膝盖关节软骨的丧失，并降低了关节炎研究国际协会（OARSI）评分，表明Nav1.7在关节炎进展中发挥作用（图2a和b）。

在Nav1.7^{DRG;chondrocyte}小鼠中，观察到显著减少的骨赘形成、骨下骨板增厚、伴有较少滑膜炎证据，这暗示Nav1.7在DMM（内侧半月板不稳定）模型中影响OA结构性病变（图2c至e）。在行动活性和机械性痛觉敏感性测试中，Nav1.7^{DRG;chondrocyte}小鼠展现出更高的整体活动距离和明显减少的机械性痛觉过敏（图2f至h）。将Nav1.7在软骨细胞中删除后，观察到DMM诱导的软骨丢失、骨赘形成、骨下骨板增厚和滑膜炎评分的显著减少，同时也减轻了行动活性丧失和机械性痛觉过敏（图2i至m）。删除软骨细胞中的Nav1.7减少了DMM模型中的痛觉行为，表明Nav1.7在软骨细胞中对OA相关的疼痛行为具有调控作用（图2n至p）。这些结果表明，软骨细胞和DRG神经元中表达的Nav1.7同时对调节OA的进展和相关疼痛具有重要作用。

图2 | 软骨细胞Nav1.7消除保护免受骨关节炎侵害并减轻疼痛。

【Nav1.7阻断调节软骨细胞】

Nav1.7阻断在OA模型中对软骨细胞产生促进合成和抑制分解的效应。通过对软骨细胞进行体外研究，发现IL-1β诱导的编码分解分子的基因表达（如MMP13、ADAMTS5、COX2和NOS2）受到1µM TTX的抑制。ProTx II和PF-04856264等Nav1.7选择性阻断剂也表明了Nav1.7在抑制IL-1β诱导的分解作用中的重要性。从PF-04856264和ProTx II处理的分泌物中筛选出满足一定条件的蛋白质，进一步鉴定了HSP70和midkine作为特定调节因子（图3a和b）。通过添加特定抗体验证了这些条件培养基对软骨细胞生物学的影响，显示出HSP70和midkine在条件培养基对软骨细胞生物学功能的影响（图3c和d）。PF-04856264对DMM小鼠关节炎的保护作用被HSP70抑制剂VER 155008和midkine抑制剂iMDK抵消，暗示了HSP70和midkine在Nav1.7抑制介导的OA保护作用中的重要性（图3e至g）。Nav1.7的阻断通过增加HSP70和midkine的分泌来调节软骨细胞的新陈代谢，影响软骨的健康状态和OA的发展，进而揭示了HSP70和midkine在OA进程中的重要作用。

图3 | Nav1.7阻断通过增强HSP70和midkine的分泌调节软骨细胞生物学。

【Nav1.7阻断改变软骨细胞的Ca²⁺】

使用共聚焦显微镜和板阅读器测量显示，Nav1.7阻断（使用ProTx II或PF-04856264）导致人类OA软骨细胞和C28I2软骨细胞内Ca²⁺水平的变化。Nav1.7阻断减少了ATP刺激引起的初始胞内Ca²⁺的迅速增加，但随后导致持续时间更长的高Ca²⁺水平（图4a和4b）。在C28I2细胞中，钙离子载体ionomycin和细胞内可渗透的钙螯合剂BAPTA-AM的实验表明，更高的Ca²⁺信号通过Nav1.7阻断有助于调节HSP70和midkine的分泌。BAPTA-AM存在时，Nav1.7阻断对HSP70和midkine的增强分泌效应消失（图4c和4d）。使用NCX（钠钙交换蛋白）抑制剂KB-R7943预先抑制NCX后，对ATP刺激后软骨细胞胞内Ca²⁺浓度的调节作用显示，NCX对Nav1.7阻断后胞内Ca²⁺信号的调节起重要作用（图4e）。NCX抑制剂KB-R7943也使Nav1.7阻断导致的HSP70和midkine增强分泌效应消失（图4f和4g）。RT-PCR实验表明，C28I2细胞中NCX家族蛋白NCX1（也称为SLC8A1）的mRNA清晰可见，而NCX2和NCX3无法检测到（图4h）。在NCX1短干扰RNA（siRNA）敲除后，PF-04856264对Ca²⁺信号和HSP70、midkine分泌的调节效应基本消失（图4i至4l）。这些结果表明软骨细胞内Ca²⁺信号对Nav1.7阻断后HSP70和midkine增强分泌至关重要，并强调了NCX1在调节Nav1.7阻断对软骨细胞胞内钙信号和相关蛋白分泌中的关键作用。

图4 | 软骨细胞中的Ca²⁺信号传导。

【小结】

这项研究发现Nav1.7是一种与OA相关的离子通道，在OA治疗中可能成为疾病修复和缓解疼痛的潜在治疗靶点——DRG神经元表达的Nav1.7参与疼痛，而软骨细胞表达的Nav1.7调控软骨细胞生物学、软骨损失以及OA所导致的疼痛（图4m）。总之，Nav1.7阻断剂有望作为治疗OA的治疗药物，既能保护软骨免受损失，又能减轻疼痛。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-023-06888-7