郑利民教授分享肝癌组织PD-L1的表达、调控与临床意义

郑利民 教授

博士生导师

中山大学教授，国务院学位委员会学科评议组成员

荷兰Leiden大学博士，1999年被瑞典国家研究院聘为助理教授。2002年回国，先后获国家杰青和教育部***。曾任中山大学生命科学院院长和肿瘤医院生物治疗中心主任；现任中山大学教授，国务院学位委员会学科评议组成员。

多年来一直从事人免疫细胞研究，在国际期刊发表论文100余篇。回国后，以肝癌为主要模型，探讨人体肿瘤组织中免疫细胞与癌细胞之间的相互作用、调控机制及其临床意义。先后主持了国家科技重大专项（首席科学家）以及5项国家基金委重点项目。近年作为通讯作者的论文发表在PNAS、JCI、JEM和Hepatology等刊物。作为第一完成人获“国家自然科学二等奖”。2015年起，连续六年入选Elsevier 发布的“中国高被引学者（医学组）”榜单。

郑教授主要为大家分享他们实验室的工作，主要讲肝癌组织PD-L1的表达、调控与临床意义。

背景

肿瘤是地上的一个种子在合适的土壤中生长出的结果。以前做总结时，很多人主要关注癌细胞本身，实际上，肿瘤=癌细胞+适宜组织微环境。像中国人讲的南橘北枳一样，就是说橘子跟北枳这两个东西，其实是一模一样的，但因为在不同的气候和土壤环境下，就展现出了不同的这个表型。所以最近一项由Hanahan& Weinberg领导的一项研究中提到，如果要真正了解肿瘤生物学，就必须要结合微生物环境来开展研究。该研究发表在Cell上。

免疫细胞是微环境的重要组成部分。在正常组织中，每天基本都会有些细胞发生突变，或者恶变的细胞出来，这种情况下免疫细胞是起抗肿瘤的作用。在很多实体瘤中，通过临床数据的分析可以发现免疫细胞反而起着促肿瘤的作用。

因为免疫细胞同时具有抗肿瘤和促肿瘤的双向作用，所以恢复或重建组织微环境的抗肿瘤功能，可以作为肿瘤治疗的新策略。

在肿瘤免疫这一块，以往大家都在想单纯提高抗肿瘤免疫，比如回收或激活免疫细胞，总体效果都不是非常理想。最近前几年，美国免疫学家詹姆斯·艾利森（James P Alison）和日本免疫学家本庶佑（Tasuku Honjo）因为在肿瘤免疫领域做出的贡献，荣获 2018 年诺贝尔生理学或医学奖。其实主要是提出一个概念：正常组织中本来是具有抗肿瘤的功能，那是否能恢复或重建它的抗肿瘤功能？他们提出的概念让治愈癌症成为现实。他们发现，在肿瘤中，促肿瘤作用里抑制免疫的有两个很重要的分子，即“刹车”分子PD-1和CDLA4。

詹姆斯·艾利森（James P Alison）（左）

本庶佑（Tasuku Honjo）（右）

Part one

在肿瘤治疗方面，现在已经有不少公司在做免疫检查点的药物了，用的最多的就是“明星”分子PD-1。实际上用了PD-1药物后，临床上确实已经起到了一个革命性的改变。但真正的效果是不是用了这个药物后，所有病人都能好的？实际并不是。

目前PD-1和PD-L1只对一小部分患者是有效的。比如，在肝癌病人里，17年有一个国际多中心的临床试验，发现晚期肝癌中，PD-1抗体单药大概可以获得20%的临床缓解率，延长患者总生存。

但真正完全缓解的，其实远远低于这个数字，于是就提出了一些问题：

为什么只有部分病人有效？-新的机制？新靶标？

哪些是适合病人？-判断模型？知道个体化治疗·能否提升疗效？-传统治疗方案（改良与联合）关于PD-1、PD-L1抗体治疗对于哪些病人有效果，目前临床上没有一个真正的特别有效的一个标记物。现在有多个临床实验的证据提示，如果肿瘤组织中，浸润免疫细胞，特别是髓系APC上，表达PD-L1的病人与PD-1/PD-L1治疗应答相关。

免疫细胞：在外周血和组织中呈现出不同的表型

很多人大概都在做外周血和淋巴结等，但实际上，真正发病的地方，或者说是免疫细胞“打仗”的地方，可以看到外周血跟组织中免疫细胞的表型是不一样的。这也提示一点，如果将来发展一些标记物，临床组织里出来的结果可能更加可靠，更能反映实际情况。

免疫微环境：认识初级阶段，对人肿瘤了解更少

另外，一般在动物实验或体外实验中，经常可以看到有一些药物或治疗方案对抗肿瘤能达到完全缓解。实际上在临床上面很少，为什么呢？主要是人的实体瘤跟动物实验里面差别非常大。除了免疫细胞，或者是除了细胞的种类不一样以外，另外有个很重要的一点，就是小鼠的肿瘤大部分都很快形成，而人的实体瘤，是免疫系统与癌细胞长期共进化的一个结果，都处在不同的区域。

免疫细胞在肝癌组织中的选择性分布特征

郑教授的实验室一开始做免疫细胞在肝组织中的分布，发现组织中的免疫细胞不是随机分布的。

Mφ在肝癌组织不同区域的独特表型与功能

其实同样一个类型的细胞在不同的区域也是不一样的。

一个肝癌组织的连续的切片

郑教授等以前就在做了，发现Mφ多由外周血单核细胞迁移和分化而成。那么就提出疑问：肿瘤微环境如何调控Mφ表型？不同表型Mφ对预后影响如何？

得出结论：肝癌组织中，癌巢和间质中的Mφ数量均与预后成负相关

他们还发现：活化细胞数量越多，转移复发率就高。

这里就会有一个问题，活化的免疫细胞如何促进肿瘤进展？

在肝癌组织侵袭边缘的单核细胞高表达PD-L1（B7-H1）

郑教授等大概在十几年前，就当时就做了PD-L1表达在组织中，现在他们发现在肝癌组织里的癌巢区域，PD-L1主要表达在单核细胞上。

现在一些年轻的临床医做实验的仪器的话都是很灵敏的，很弱的信号都能检测出来，但分子或者细胞在组织上的表达是有差异的，所以一开始可能是用一个比较低的电压来给做曝光，然后他另外有个片子就是检测比较弱的信号的。

如果报告时间很长，里外差别是看不出来的。这说明单核细胞在肝癌组织中是表达最主要的一类。

结论：

单核细胞：在肿瘤中 表达PD-L1 分子，外周血不表达，说明受到肿瘤微环境的调节。

PD-L1 的表达程度与患者肿瘤进展正相关。

PD-L1 主要分布在癌旁间质区域。

那么为什么只有癌旁间质的单核- 巨噬细胞高表达PD-L1 分子？据此，郑教授等做了一个奇怪的试验。结果发现：活化早期的单核细胞表达PD-L1；PD-L1受单核细胞自分泌因子的调控；IL-10起主导作用，TNF-α协同。

肿瘤组织中的T 细胞高表达 PD-1 (PD-L1 受体)介导了活化单核细胞的免疫抑制作用

那么大家可能就在想肿瘤组织中表达PD-L1的话，它里面的免疫应答有什么影响呢？郑教授发现，PD-L1介导了单核细胞的免疫抑制作用。

肿瘤活化的单核细胞表达 PD-L1 诱导免疫逃逸

在体内，如果阻断单核细胞上面的PD-L1的表达，就会恢复单核细胞抗肿瘤的活性。

活化单核细胞通过诱导Th17/Th22 分化促进血管生成

那么同时那为什么还有其他的机制？还有没有促进调控肿瘤的进展呢？他们发现，活化单核细胞还是可以通过调控Th17、Th22的分化来促进血管生成。

第一部分小结：

组织特定区域 炎症反应促进肝癌进展的新机制——将活化单核细胞“ 铸剑 ( 抗肿瘤免疫) 为犁 ( 血管生成) ”

Part two

肿瘤组织：单核/ 巨噬细胞表达 PD-L1 ， 促肿瘤；可预测患者对anti-PD-1 mAb 治疗的应答

PD-L1+ 单核/ 巨噬细胞： 具有抗肿瘤潜能？

根据前面的结果，大家可能会想，在肿瘤组织中，单核、巨噬细胞表达PD-L1，可以促肿瘤，有助于疾病的进展。但实际上，最早提到单核、巨噬细胞表达PD-L1时，是可以预测病人对PD-L1抗体治疗的应答。意思就是，在肿瘤组织中，它表达PD-L1的分子时，尽管这个分子是不好的，但其实这些病人进行治疗后效果是比较好的。那为什么这个分子不好病人治疗还好呢？其实根据上面的结果，可以知道为什么免疫细胞会表达PD-L1，说明这个免疫细胞是一个活化的。意思就是，如果在肿瘤组织中，看到单核细胞、巨噬细胞表达PD-L1，这说明这个组织实际上具有抗肿瘤潜能。所以，如果阻断PD-L1，就有可能恢复其抗肿瘤性。

举个例子，PD-1和PD-L1都是“刹车”分子。如果说你去看两辆车，有一辆车刹车不好，还有一辆车子刹车非常强。那可以推测出来哪一辆车的发动机比较好，如果要修车，肯定是去修刹车比较强的那台。因为这个车要这么强的刹车就说明这个车的发动机是非常有利的。如果把它的刹车修好了，那它的启动就会非常快；如果车连刹车都没有，那可以推断出车可能修后发动机也不行。

于是，当时郑教授等与上海中山医院肝癌研究所等一起做了450余例的PD-L1在肝癌癌巢中的表达。他们发现，PD-L1样本病例中，大概有将近30%的病例是阳性的。在70%的病人里，巨噬细胞和肿瘤细胞都不表达PD-L1。他们还发现，同样一个免疫分子表达不同类型细胞上，它对于愈合状态是不同的影响。同时，他们也做了多重荧光染色，发现免疫细胞PD-L1的表达是在单核/巨噬细胞上面的。

大家自然就会想，单核/巨噬细胞的组织环境是什么样呢？

巨噬细胞上高表达 PD-L1 -- 活化的组织微环境巨噬细胞上高表达 PD-L1： 组织高表达多种肿瘤抗原

这给大家一个提示：

肿瘤治疗的新思路——联合治疗

如果将来做肿瘤治疗，这可能提供一个新的思路。热肿瘤是具有免疫原性的，里面很多免疫活化的细胞，这些病人给他们用PD-1/PD-L1进行治疗，可能会有相对好的效果。但在临床上，这其实占很少，绝大部分病人实际上没有免疫原性。因为肿瘤经过人身体里跟免疫系统长期得共进化后，就没有了免疫原性。那怎么办呢？如果结合其他的治疗，比如在里面用溶瘤病毒，有射频的消融，或者用其他的一些治疗方案，也要用到局部产生炎症反应里面，就有可能营造一个相对活化的免疫环境，然后再进行治疗，就会有一个比较好的效果。

那么肿瘤细胞表达PD-L1是怎样调控的呢？如果在肿瘤组织中，主要高表达EZH2，它能负调控IFN-γ诱导的PD-L1表达在肝癌细胞上。在很多阳性病例中，很多不表达EZH2。

肝癌肿瘤细胞中EZH2 调控PD-L1 表达模式图

那么单核细胞为什么会高表达PD-L1？免疫细胞的活性是受到所处的环境的调控，于是郑教授等就去观察了正常组织中营养缺乏的环境里的糖酵解，发现肿瘤相关单核细胞的有氧糖酵解效应显着提高。如果在其中使用糖酵解抑制剂时，就会明显抑制PD-L1的表达。在其他的系统里，糖酵解并非通过PKM2-HIF1α调控TAM 表达PD-L1，糖酵解通过PFKFB3 调控TAM 表达PD-L1，PFKFB3 调控PD-L1 表达并与效应T 细胞功能显着相关。

总结：

肝癌组织中PD-L1 的表达：

1. 不同区域 - 独特的分布；不同细胞— 独特功能。

2. 免疫细胞：PD-L1 主要表达在活化 的单核/ 巨噬细胞上 ；伴随活化的肿瘤微环境；具有回复抗肿瘤免疫应答的潜能 ( 通过阻断PD-1/PD-L1)

3. 肿瘤细胞： 主要受IFNγ 诱导，EZH2 可通过调节PD-L1 和IRF-1 启动子的H3K27me3 水平来调控PD-L1 表达。

4. 思考：如何更好/ 合理的调控免疫应答— 新的治疗策略？

（包括联合 EZH2 抑制剂以及代谢调控分子等）