病理干货 | 系统汇总MET基因变异检测方法及靶向治疗

01 关于MET基因

MET基因编码c-MET酪氨酸激酶受体，该受体的配体是肝细胞生长因子(HGF)。在正常细胞中，HGF与c-MET蛋白结合后，启动一系列的细胞内信号传导来介导胚胎发育、伤口愈合等过程。研究表明，MET信号通路的异常在肿瘤侵袭、血管生成、肿瘤转移中起到非常关键的作用。MET基因突变可以引起MET信号通路的异常，基因突变形式包括MET 14外显子跳读突变、MET激酶区点突变、MET基因扩增等多种类型^[1]。

图1.MET基因变异类型

在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，MET 14外显子跳读的发生率约1%-4%，而在肺肉瘤样癌（PSC）患者中的发生率可高达22%（9–22%）^[2-4]。2022版NCCN指南（NSCLC）指出MET 14外显子跳读突变在不吸烟的老年女性NSCLC中更常见。在NSCLC患者中，MET扩增的发生率约1-6%，其中高拷贝数扩增（GCN≥10）的发生率约2%。在三代EGFR-TKI抑制剂的耐药机制中，由于MET基因扩增导致的耐药的患者比例更高达15%-19%。因此MET基因扩增也成为肺癌治疗的新靶点^[5]。

在多种实体瘤中都发现有原发MET扩增，根据肿瘤基因组计划（TCGA）和cBioPortal数据库提供的数据，胃癌中约1-10%；大约2-4%的结肠癌（CRCs），13%左右的I型肾乳头状癌(PRCCs)和3%左右的II型肾乳头状癌也检出MET扩增，但在食管癌和肝细胞癌中检出比例较低。

图2.不同分期NSCLC中驱动基因突变种类

02 关于MET靶向药物

MET激酶与其他蛋白激酶的结构类似，N端为5个β折叠和一个α螺旋（C-螺旋），C端为6个α螺旋，两端通过柔性的铰链区连接，该区域为ATP结合位点，活性loop区域通常有20-30个氨基酸残基组成，从保守的DFG序列（通常是Asp-Phe-Gly）开始，延伸到 APE序列（通常是Ala-Pro-Glu）。根据DFG构象，可分为激酶活性构象（DFG-in）和激酶非活性构象（DFG-out）。

根据作用机制，针对MET基因突变的TKI（MET-TKI）可分为3种类型（I型、II型和III型，见右下图）。I型抑制剂是指与激酶活性构象（DFG-in）结合，又根据是否与溶剂前沿残基G1163位点（类似于ALK的G1202和ROS1的G2032位点）结合进一步细分为Ia、Ib（区别在于Ib型TKI可以结合的位点较少，因此特异性较高）；II型是指与激酶非活性构象（DFG-out）结合，是多靶点TKI，对产生二次突变的MET仍具有抑制作用，或许可以逆转由Y1230等突变引起的I型MET-TKI耐药。

图3.典型蛋白激酶结构域^[6]

图4.MET-TKI分型^[7]

表1 肺癌MET靶向药物列表

而在其他实体瘤中研究发现MET扩增水平和MET抑制剂疗效呈正相关。PROFILE 1001研究是最早开展的关于MET抑制剂疗效和MET扩增程度相关性的研究，研究纳入肺癌，肾癌，结肠癌，胃食管癌，肝癌等实体瘤患者分别分为低度扩增组（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2），中度扩增组 （MET / CEP7>2.2 ，<5）和MET高度扩增组 (MET /CEP7 ≥5)，结果提示高度扩增组的客观反应率(ORR)可达67%，低扩增组和中扩增组的客观反应率ORR分别为0%和17%。随后研究组将中度扩增组界定值调整为MET /CEP7值为2.2-4.0，高扩增组界定为MET /CEP7 ≥4.0，最终结果提示总体临床获益最显著的也是高度扩增组，其ORR为40%，中位无进展生存期(PFS)为6.7个月，而低度扩增组和中度扩增组的ORR分别为33%和14%，PFS分别为1.8个月和1.9个月^[8]。

图5.MET扩增肿瘤患者的靶向治疗及其有效性

03 关于MET基因扩增

MET的扩增即基因局部扩增或者染色体倍增。相比染色体倍增，局部扩增使MET发生的扩增更易导致癌症的发生。常用荧光原位杂交（FISH），定量实时PCR（qRT-PCR）和二代测序（NGS）等方法进行检测。

检测方法：

FISH：MET扩增常用FISH检测，是业内公认的组织c-MET基因扩增检测的金标准。FISH即荧光原位杂交技术，以荧光探针标记MET基因和7号染色体着丝粒数，计算MET拷贝数及比例，可以直接观察到单个肿瘤细胞的MET扩增状态。

图6.MET扩增原理

目前按照MET/CEP7比值分层，如下：

NGS方法：临床上使用了两种NGS的检测方法：基于扩增的NGS和基于杂交捕获的NGS。这些技术在DNA富集方法方面有所不同。简而言之，基于杂交捕获的NGS能够更准确地评估MET和其他基因中拷贝数的变化，可以对基因组更广泛区域进行检测，以及对重复序列的鉴定，从而可以更准确地确定序列覆盖深度和总拷贝数变化。使用NGS检测时需要考虑以下几个问题。首先，拷贝数增加和/或减少的检测取决于肿瘤纯度和样本的选择，因为非恶性细胞在分析过程中经常与恶性细胞混杂在一起。其次，使用质量差的DNA（长期储存的肿瘤样本）可以导致噪声水平的增加，使拷贝数的准确性分析变得更加困难。第三，测序深度作为拷贝数评估的关键要素，使用的序列必须具有一定的深度和均匀覆盖度，才能提供准确的临床结果。

qRT-PCR：与FISH和NGS相比，该技术不能很好的测定MET扩增。同样，判定MET扩增的阈值也不同，没有明确的标准化规则。

最后，FISH、NGS、PCR都可以用于MET扩增的检测，其中组织FISH是扩增检测的金标准，仍是更好的MET扩增检测方法。

04 关于MET基因突变

激活突变可发生在MET内不同的位置，包括激酶结构域、14号外显子两侧的内含子剪接位点和胞外结构域。其中以14号外显子跳读最为常见。

作为自身负反馈调节的一部分，MET激活导致MET激酶激活环内14号外显子编码的近膜结构域Y1003残基发生磷酸化，该残基的磷酸化介导MET与c-Cbl E3连接酶的结合，导致泛素化并最终导致MET降解。MET第14号外显子的突变具有异质性，它们均能够干扰该过程并导致MET信号持续增强。这些突变中最常见的是碱基取代或插入缺失，在50%MET突变的患者中均有发生。

大多数MET 14号外显子突变都会干扰RNA剪接。在野生型中，转录本翻译成蛋白质之前，mRNA前体内含子区域会被剪切，然后再翻译成蛋白质。MET 14号外显子突变会干扰该剪接过程，导致14号外显子被跳读。编码的近膜结构域的丢失导致MET上Y1003泛素结合位点的丢失。因此，MET降解减少导致MET表达增加，从而驱动致癌作用。这些剪接位点突变中的大多数都以插入缺失的形式存在，其大小范围很广。

不直接影响剪接的MET突变有相似的表型。例如，Y1003替换的突变能够干扰其与c-Cbl E3连接酶的结合。与MET 14 号外显子RNA剪接位点突变相似，Y1003替换会导致细胞增殖水平提高并促进肿瘤生长。包含14号外显子在内的大片段缺失也会导致携带Y1003的近膜结构域丢失^[9]。

图7.MET突变原理

检测方法：

DNA-NGS：MET 14号外显子的突变高度异质；因此，有效的NGS分析必须能够捕获这些多样的突变。如前所述，基于扩增的NGS和基于杂交捕获的NGS是临床上使用的两种主要检测方法。与基于杂交捕获的方法相比，基于扩增的NGS使用特定引物对目的基因进行测序，虽然检测重复区域和等位基因缺失时容易发生错误和偏倚，但是这种方法缩短检测时间，并能更好地捕获目标区域和难以测序的区域。

这两种方法通常都有很高的覆盖深度，检测结果具有较高的准确性，显然NGS已成检测MET14号外显子突变的一种有效方法。

RNA-NGS：RNA测序平台有力补充DNA-NGS检测的缺点。RNA测序可以直接鉴定MET 14号外显子的转录缺失。此外，由于在mRNA中不存在内含子，RNA的测序避免了对大片段内含子进行测序的挑战。但是，RNA的稳定性差，极容易降解，因此检测样本的保存至关重要。此外，考虑到非恶性和肿瘤组织中mRNA表达的高度多变性以及解释结果的困难性，RNA测序目前被用作传统测序方法的辅助手段。有研究显示基于RNA和DNA的NGS诊断MET外显子14跳跃突变具有高度一致性^[10]。

05 关于MET过表达

在许多情况下都应考虑MET表达在肿瘤发生中的作用。首先，在缺氧和/或炎症的情况下，MET可以在癌细胞中被转录诱导，激活细胞增殖，减少细胞凋亡并促进细胞迁移。因此，即使在缺少基因组驱动因素（例如MET扩增，突变或融合）的情况下，肿瘤也可能依赖于MET信号传导。目前正在探索新型的MET靶向策略，例如双特异性抗体（作用于同一目标蛋白的两个不同位点）联合ADC治疗。其次，MET可能在具有激活突变的肿瘤中过表达，例如具有原发和/或继发MET扩增或MET 14号外显子突变的肿瘤。

检测方法：

免疫组化（IHC）：许多抗MET抗体已常规用于MET的IHC检测。包括单克隆抗体（例如SP44，cMET和MET4），多克隆抗体（例如多克隆MET AF276）和磷酸化MET抗体（例如pMET Y1349）。在这些抗体中，使用最多的是SP44（一种兔单克隆抗总MET抗体)。病理学家评估的IHC染色的程度和强度是MET蛋白表达的半定量指标^[9]。

质谱分析（SRM-MS）：SRM-MS能够定量分析福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中的MET蛋白。与IHC相比，SRM-MS不容易受到观察者的影响，并且能够检测到较低水平的蛋白质表达。然而，SRM-MS不能区分表达的蛋白为肿瘤组织还是非恶性组织，因此MET定量可能受基质和/或炎症浸润的影响。此外，SRM-MS在技术上比IHC要求更高，成本更高，所以这种方法目前未被广泛采用^[9]。

筛查：MET过表达已被研究作为筛选MET激活突变患者的一种方法。但是，MET过表达并不是MET扩增或MET 14号外显子突变的可靠指标。

总结：

从临床应用上，需要定义出对包括MET扩增或MET表达水平在内的连续变量进行标准化的临床意义分界点，才能够确定MET是否发生变异。虽然检测方法有多种，FISH仍是MET基因扩增检测更好的方法；MET 14外显子跳跃突变，基于DNA NGS的检测方法具有较高的检出率，必要时，RNA检测可作为DNA-NGS检测的辅助诊断；免疫组化（IHC）已常规用于MET过表达检测。除此之外，MET靶向治疗在许多MET依赖型肿瘤中均有疗效，MET的突变类型和肿瘤依赖MET信号决定了选用何种靶药及靶药疗效，因此有效检测MET的突变类型对肿瘤治疗非常重要。

参考文献

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2.Guo Robin,Luo Jia,Chang Jason et al. MET-dependent solid tumours-molecular diagnosis and targeted therapy.[J] .Nat Rev Clin Oncol, 2020.

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6.Recondo G, Che J, Jänne PA, et al. Targeting MET Dysregulation in Cancer. Cancer Discov. 2020 Jul;10(7):922-934. doi: 10.1158/2159-8290.CD-19-1446. 

7.Modi V, Dunbrack RL Jr. Defining a new nomenclature for the structures of active and inactive kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Apr 2;116(14):6818-6827. doi: 10.1073/pnas.1814279116.

8.Robin Guo, Jia Luo, Jason Chang,et al.MET-dependent solid tumours molecular diagnosis and targeted therapy.Nature Reviews Clinical Oncology volume 17, pages 569–587(2020).

9.Guo Robin,Luo Jia,Chang Jason et al. MET-dependent solid tumours - molecular diagnosis and targeted therapy.[J] .Nat Rev Clin Oncol, 2020, 17: 569-587.

10.Li Yan,Gao Lianju,Ma Di et al. Identification of MET exon14 skipping by targeted DNA- and RNA-based next-generation sequencing in pulmonary sarcomatoid carcinomas.[J] .Lung Cancer, 2018, 122: 113-119.