Nat Commun：序列末端依赖性PCR方法——STEM-PCR，以单碱基分辨率识别位点特异性突变
2023-03-31 小鹿-先森 测序中国 发表于上海
研究团队展示了一种简单通用的PCR策略来识别核酸修饰和单碱基突变。该方法被命名为特异性末端介导PCR，具有高特异性，并且能够以单碱基分辨率识别任何序列的位点特异性变异。
核酸位点特异性突变已被证实可以作为疾病的临床生物标志物，包括癌症、神经系统疾病等。单碱基分辨率核酸分析新方法的发展，如纳米孔和单分子实时测序方法，有助于检测核酸位点特异性变化，包括单碱基突变。但这些方案实施起来相对复杂，限制了其在临床中的应用。
目前，聚合酶链式反应（PCR）被整合到许多常规临床分析工作流程中。但目前这些方法还不能在单碱基水平上识别位点特异性突变，也不能检测表观遗传碱基修饰，使得多个研究团队开发了增强型或改良型PCR方案。
近日，来自上海交通大学生物医学工程学院/Med-X研究院的研究团队在Nature Communications发表了题为“Sequence terminus dependent PCR for sitespecific mutation and modification detection”的文章。研究团队展示了一种简单通用的PCR策略来识别核酸修饰和单碱基突变。该方法被命名为特异性末端介导PCR（Specific Terminal Mediated Polymerase Chain Reaction, STEM-PCR），具有高特异性，并且能够以单碱基分辨率识别任何序列的位点特异性变异。
文章发表在Nature Communications上
科学与技术
1 STEM-PCR的设计理念和优化
STEM-PCR依赖于对目标序列的简单处理，从而产生一个携带特定末端部分的分子结构，并具有自折叠和启动PCR引物结合进行扩增的能力。因此，该技术只需要一个简单的DNA序列工具箱和形成复合物的特定设计机制。
研究团队首先展示了利用限制性内切酶（RE）消解的STEM-PCR策略进行位点特异性检测的基本概念。当目标序列存在时，酶消化产生具有特定5 '末端的序列P1，未消化的目标保持完整。在扩增步骤中，P1作为模板，通过定制设计的可折叠引物（TFP）启动线性链合成，该引物与已消化和未消化的模板杂交。对于被消化的分子P1，这一过程止于5 '端，生成一个可以自折叠（P2）和自启动的结构，形成一个完整的发夹结构（P3），没有3 '端突出。对于未消化的分子，继续合成，防止自启动（P4）。完整的发夹结构（P3）使用人造引物（Artificial primer, AP）启动指数扩增过程。
与传统PCR扩增相比，STEM-PCR识别序列特异性信息能力的创新，是通过处理模板和TFP的不同序列成分设计的中间结构的生成。折叠区域（FR）的长度对稳定性的影响可转化为更高的放大效率。
图1. STEM-PCR设计原理图，来源：Nature Communications
2 STEM-PCR检测单位点甲基化
为了验证STEM-PCR策略，研究人员将DNA甲基化和突变作为具有重要实际临床意义的案例研究，并设计了三种具有高临床相关性的测定方法来检测DNA甲基化，包括同时检测多个位点的甲基化。
验证结果显示，STEM-PCR与未甲基化序列无交叉反应，且没有敏感性损失。STEM-PCR产物对应的条带进行测序，发现末端存在AP和TSP，表明STEM-PCR的机制和反应步骤符合预期。
图2. STEM-PCR有效检测单位点甲基化，来源：Nature Communications
3 利用STEM-PCR检测单碱基突变
研究人员使用STEM-PCR检测了EGFR中的L858R单碱基突变，发现该方法表现出与酶法相似的高性能，即使在3000拷贝/反应的浓度下，也具有30拷贝/反应的敏感性和高特异性。
图3. STEM-PCR有效检测单碱基突变，来源：Nature Communications
4 STEM-PCR检测共甲基化
为证明STEM-PCR可以很容易地用于检测共甲基化，研究人员从培养细胞中提取人类基因组DNA，并将其碎片化到约150 bp作为ctDNA甲基化的模型，共甲基化分析结果显示了该方法的特异性，并通过反应产物测序得到了证实。
图4. STEM-PCR检测共甲基化的能力，来源：Nature Communications
结 语
遗传变异的检测促进了用于诊断目的的方法和分析的发展。但每种方法都有其自身的缺点，包括敏感性、特异性和/或所需的冗长处理。相比之下，该研究提出的STEM-PCR是一种简单有效的策略，是一种可检测不同修饰且值得推广的方法。该方法基于中间二级核酸结构的生成，使用一组引物序列与目标序列特异性相互作用和杂交，生成具有明确末端结构的构建物，可以自我折叠成发夹结构和自我启动用于PCR扩增。
研究人员通过多种方式证明了该方法的潜力，该方法不使用亚硫酸氢盐制备，而是使用酶消化，以检测单个或多个甲基化位点，以及用于无酶测定。同时，该技术可以很容易地扩展到使用基因编辑工具的其他方法，例如CRISPR。
参考文献：
1. Xu, G., Yang, H., Qiu, J. et al. Sequence terminus dependent PCR for site-specific mutation and modification detection. Nat Commun 14, 1169 (2023).
2. Tse, O. O. et al. Genome-wide detection of cytosine methylation by single molecule real-time sequencing. Proc. Natl Acad. Sci. USA 118, e2017421118 (2021).
3. Widschwendter, M. et al. Epigenome-based cancer risk prediction: rationale, opportunities and challenges. Nat. Rev. Clin. Oncol. 15, 292–309 (2018).
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