Nat Commun干细胞药理学研究新发现：激活自噬可清除tau蛋白

Tau蛋白病变疾病主要表现为受损脑区神经元以及胶质细胞tau蛋白异常聚集和功能失调，这些疾病包括额颞叶痴呆（FTD）、进行性核上性麻痹（PSP）和阿尔茨海默病（AD）。遗憾的是，目前尚无针对tau病变的有效药物，能够到达临床试验的tau靶向药物也少之又少。大量证据表明相较于晚期tau的纤维缠结，早期tau蛋白的异常定位、寡聚化和溶解性质的改变与神经毒性的关联性更强。因此，寻找清除早期tau蛋白的方法可能有助于tau蛋白病变疾病的治疗。

哈佛医学院的Haggarty教授团队对tau病变病人的诱导性多能干细胞（iPSC）诱导形成的神经元细胞进行药理学研究，发现了tau蛋白清除的自噬机制和小分子药物。该研究于2020年6月发表于Nature Communications，题目为Prolonged tau clearance and stressvulnerability rescue by pharmacological activation of autophagy in tauopathyneurons。

Haggarty教授目前供职于哈佛医学院神经病学系和麻省总医院基因组医学中心，是化学神经生物学实验室主任和精神病学系药物实验和诊断中心负责人。其团队主要致力于研究使神经系统能够感知、适应和响应各种内外刺激的神经可塑性的分子和细胞机制，从而发掘靶向治疗和预防神经精神疾病的药物。

1tau蛋白病变神经元中自噬功能受损和人神经元自噬激活剂的发现

既往研究发现自噬功能受损是蛋白病变的一个重要特征。为了研究这一点，该团队分别诱导了两个无tau病变受试者、1个携带tau-A152T风险变异的PSP病人和1个携带常染色体显性变异tau-P301L的FTD病人的iPSC。这些病人的iPSC诱导形成的神经元细胞中均表达内源性的tau蛋白并能较好的模拟疾病相关表型。检测发现，自噬-溶酶体途径的相关标志物如与底物选择和自噬小体合成相关的蛋白LC3-II，溶酶体相关膜蛋白LAMP1和LAMP2以及泛素结合自噬受体蛋白p62在tau病变神经元中均是升高的，提示tau蛋白病变引起自噬功能受损。

基于以上证据，该团队在无tau病变受试者神经元细胞中对240个小分子药物进行筛选寻找人体外神经元的自噬激活剂，最终发现了OSI-027、AZD2014和 AZD8055三个化合物相较于雷帕霉素在自噬激活中表现更加突出（图1）。

图1. 人体外神经元中激活自噬的化合物筛选

2mTOR抑制剂可以降低FTD病人iPSC神经元的tau负荷并挽救tau介导的神经元应激障碍

以上三种化合物被预测为ATP竞争性的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂。为了进一步研究这些可以激活自噬的化合物在tau病变神经元中的作用，该团队用不同浓度的OSI-027、AZD2014和 AZD8055（0.1uM-10uM）分别处理tau-A152T和tau-P301L变异的神经元24小时，并检测神经元中的总tau蛋白（T-tau）和磷酸化tau（P-tau）水平。结果表明，这三种化合物不影响神经元活性并最大程度降低tau蛋白的药物浓度是10uM（雷帕霉素为3uM）。此外，在FTD病人诱导的神经元细胞中，tau蛋白的聚集往往和神经元应激障碍并存，而这种应激障碍会在淀粉样蛋白β（Aβ）和兴奋性神经递质NMDA的刺激下表现的更加显著。该团队先使用mTOR抑制剂处理携带A152T变异的神经元8小时，之后加入Aβ和NMDA，随后检测细胞活性。溶剂对照组细胞活性仅为30%，雷帕霉素处理组挽救60%溶剂对照组的细胞活性，AZD8055挽救70%，OSI-027挽救80%，AZD2014挽救100% （图2）。

图2. 挽救tau-A152T神经元的应激障碍

3mTOR抑制剂处理的神经元的溶酶体可以募集tau蛋白

为了进一步研究mTOR抑制剂清除tau的机制，该团队使用10uM AZD2014、10uM OSI-027以及空白对照分别处理tau-A152T和tau-P301L神经元，并分别提取其溶酶体蛋白、外泌体蛋白和胞浆蛋白。结果表明，使用了mTOR抑制剂后，tau蛋白和P-tau主要富集在溶酶体中，而胞浆中的tau蛋白水平降低。

4mTOR抑制剂对降低tau蛋白水平和毒性存在延长效应

使用mTOR抑制剂处理24小时的神经元tau蛋白的水平是降低的，但这一降低效应是瞬间的还是可以长久维持的呢？为了解答这一疑问，该团队使用10uM OSI-027和AZD2014两种药物处理A152T神经元24小时（3uM雷帕霉素作为对照），更换新鲜培养基并在之后的20天内每天检测tau蛋白水平和神经元活性。在第一天的检测中，OSI-027和AZD2014均降低了60%的tau蛋白水平，雷帕霉素降低了40%。在第8天，OSI-027降低了80%的tau水平（空白对照组降低了20%）；在第12天，AZD2014降低了80%-90%的tau水平。在第12天，雷帕霉素处理后的神经元tau水平开始升高，而OSI-027和AZD2014处理过的神经元需要16天才开始回升。以上结果提示mTOR抑制剂对降低tau蛋白水平有延长效应，OSI-027和AZD2014比雷帕霉素有更强的延长效力。（图3）图3. mTOR抑制剂对tau蛋白的延长效应

结 论

Tau蛋白病变是脑中存在tau蛋白异常聚集的神经变性病的共同特点；病人的iPSC诱导形成的神经元细胞模型可以在体外模拟疾病表型，成为药物研究的重要工具。

该研究在人神经元中发现自噬可以降低tau负荷，同时mTOR抑制剂OSI-027、AZD2014和AZD8055可以显著降低磷酸化和不溶性tau的含量并能够改善由tau导致的神经应激障碍。mTOR抑制剂对神经元自噬的调节机制可能有助于促进治疗tau蛋白相关病变的药物研发。

值得注意的是，mTOR抑制剂在肿瘤治疗、器官移植和临床试验中被证实有较多副作用，这可能会给药物的应用带来不便，但这些副作用大多是剂量或给药频率相关并且是可逆的。该研究发现了OSI-027和AZD2014对tau蛋白的延长效应，也许未来可以通过间歇给药方案来抵消部分副作用并提高患者对药物的耐受性。