最强PCR原理攻略

一.PCR简介

生物学可以被划为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR。没有PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）技术，就没有现代分子生物学。PCR技术发明者Kary Mullis，在1993年获得化学诺贝尔奖，世界称之为PCR教父。

生物体的基因组存储在DNA分子内部，但是分析这种遗传信息需要大量的DNA。1985年，Kary Mullis发明了一种有效的方法，该方法可在短时间内大量复制少量DNA。通过加热，DNA分子的两条链被分离，并且已添加的DNA构件与每一条链结合。借助酶DNA聚合酶，可以形成新的DNA链，然后可以重复该过程。PCR在医学研究和法医学领域都具有重要意义。

二.PCR是干什么的?

PCR全称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），是一种非常强大的技术，可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制DNA，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

三.PCR的原理是什么?

我们知道DNA复制时，以亲代DNA的两条链分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，组成新的DNA分子，新形成的两个子代DNA与亲代DNA的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，而另一条链是新合成的，因此这种复制方式称为半保留复制。

用简单的方式来理解PCR就像是 “心灵手巧的小姑娘学习织围巾” 在织围巾(PCR)的过程中，首先拆解原始织样得到元素织样(模板DNA)、起针(引物对)、毛线(dNTP)和针(Taq酶以及缓冲液体系)串起来，让DNA分子无处可逃。

四.PCR实验基本步骤

PCR反应准备工作

1.PCR反应体系

• 10×扩增缓冲液 10μl

• 4种dNTP混合物（终浓度） 各100～250μmol/L

• 引物（终浓度） 各5～20μmol/L

• 模板DNA 0.1～2μg

• Taq DNA聚合酶 5～10 U

• Mg2+（终浓度） 1～3mmol/L

• 补加双蒸水 100 μl

其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整，以上数据仅供大致参考值。

PCR反应五要素：

• 引物：(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。

• 酶：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

• dNTP包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP

• 模板：模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。

• 缓冲液：（其中需要Mg2+）

  缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：

  缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；

  一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；

  二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；

  辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。

  2.PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

1. 引物设计的基本原则

• 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

• 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

• 引物内部不应出现互补序列。

• 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

• 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

• 引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

• 引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

3.模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

4.反应的控制

1. PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子

2. 镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L

3. 底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L

4. TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）

5. 引物 浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L

6. 反应温度和循环次数

• 变性温度和时间 95℃，30s

• 退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃

• 延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）

• Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”

循环参数设置

1.预变性：模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3.引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5.循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6.最后延伸：在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

PCR反应步骤

标准的PCR过程分为三步：

DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，

从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。

如图所示：现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

PCR反应特点

1.特异性强

PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

2.灵敏度高

3.简便、快速

4.纯度要求低

PCR反应结果的检测

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

常见问题

1.假阴性

不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及溴乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

2.阴性

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

3.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

实验所需试剂