GRAMD1A在HCC发展和治疗中的作用

据报道2014年全球约有78.2例新发HCC病例和74.5万人死亡[1]，其中我国新发病例和死亡病例占了约50％[2, 3]。尽管在诊治上取得了一定的进展，但由于其高转移能和抵抗治疗特性，患者手术切除、化疗、放疗后复发率仍居高不下，因此寻找新的预后因子和治疗靶标对我国科学家来说是一个巨大的挑战。

GRAMD1A是一个新发现的基因，其首先在人胚胎干细胞中被发现，且在外胚层、中胚层、内胚层组织及许多肿瘤细胞中均表达[4]，但其在各种疾病发生发展中的功能尚未被完全阐明。最近研究报道，GRAMD1A在HCC组织中表达上调，其表达与HCC病理分化程度和生存状态呈显著正相关，高表达GRAMD1A的患者预后差，可作为HCC患者的独立预后因素；且过表达GRAMD1A可促进HCC干细胞自我更新、抵抗药物治疗和促进肿瘤生长[1]。然而，沉默GRAMD1A是否会通过STAT5通路增加肝癌细胞放化疗敏感性仍然未知。

在本研究中，我们将通过慢病毒方法构建稳定敲减GRAMD1A的肝癌Huh7细胞株，研究沉默GRAMD1A后Huh7细胞对肝癌临床小分子药物Sorafenib化疗敏感性及放疗敏感性的影响，进一步揭示GRAMD1A在HCC发展和治疗中的作用，为临床靶向与联合治疗HCC提供新靶点。

1 材料与方法

1.1细胞培养和稳转株构建
肝癌Huh7细胞和293T细胞购自中科院上海细胞所,，两株细胞均在含有1%青链霉素，10%胎牛血清的DMEM（Gibco）中，于37°C，5% CO2潮湿大气中培养。GRAMD1A shRNA（GCGGCATTGAAGACTATTTCC）由生工生物合成并克隆至慢病毒载体pLKO.1-puro中，用293T细胞进行慢病毒包装，感染Huh7细胞，用0.5mg/ml嘌呤霉素筛选获得稳定敲减GRAMD1A的Huh7稳转株。

1.2 western blot检测
取处理细胞用RIPA裂解获得总蛋白，12% SDS-PAGE电泳分离蛋白并转至PVDF膜，GRAMD1A抗体（sigma）、GAPDH（碧云天）一抗稀释液孵育条带，用化学发光液ECL于western blot仪（Bio-Rad）上显影，后用Image J进行蛋白相对定量。

1.3 qPCR检测
用TRIzol（Invitrogen）提取总RNA，后用Script II reverse transcriptase (Invitrogen)逆转录试剂盒反转录，用2xSYBR green master mix（Applied Biosystems）于ABI Prism 7500 qPCR仪上进行基因相对表达检测，以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt法来计算基因相对表达量。基因引物如下：GRAMD1A：F- TCAGTGCTACGGCTCAGAG和R-GGGCGATCACATCTCCCAC；STAT5：F- GAACACCCGCAATGATTACAGT和R-ACGGTCTGACCTCTTAATTCGT；Cyclin D1：F-CAATGACCCCGCACGATTTC和R-CATGGAGGGCGGATTGGAA；c-Myc：F-GTCAAGAGGCGAACACACAAC和R-TTGGACGGACAGGATGTAT
GC；c-Jun：F-TCCAAGTGCCGAAAAAGGAAG和R-CGAGTTCTGAGCTTTCAA
GGT；Bcl-2：F-GGTGGGGTCATGTGTGTGG和R-CGGTTCAGGTACTCAGTCA
TCC； GAPDH：F-GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA和R-ACCTTCC CCATGGTG
TCTGA。

1.4细胞活力检测
取生长状态良好的细胞，取3000个/100ul接种于96孔板中，过夜贴壁后，加入0、2.5、5、10、20μm的Sorafenib，每组设三个复孔，置于细胞培养箱培养48h，后每孔加入20μl MTT，继续培养4小时，弃上清并加150μl DMSO，于酶标仪上振荡10分钟，测570nm波长下各孔吸光值。

1.5 PI/Hoechst细胞死亡检测
用5μM的Sorafenib处理细胞48小时后，按照先前文献所述[5]，加入5ug/mL PI和5ug/mL Hoechst 33342进行细胞染色，然后用荧光显微镜（Zeiss Axio Observer A1）观察拍照。PI阳性细胞被认为是死亡或晚期凋亡细胞，而Hoechst 33342阳性细胞是正常或早期凋亡细胞。使用Image pro plus 6.0分别计数PI或Hoechst33342阳性细胞。

1.6 克隆形成检测
取处理后细胞并以3000/2ml接种于6孔板中，过夜贴壁后，接受2Gy的X线照射，然后置于细胞培养箱中继续培养，14天后取出，弃去旧培养液，PBS洗三次，甲醇固定10分钟，晾干后0.1%结晶紫染色，双蒸水洗去残留结晶紫，晾干后于显微镜下观察并拍照，计数各孔克隆数，只计单个多于50个细胞的克隆。照射条件如下：6 MV 光子线，源皮距 (SSD)为100 cm，照射野10cm×10cm，剂量 DT =2Gy，射野覆盖全细胞培养板。

1.7 细胞凋亡检测
用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，冷的PBS洗涤2次，取1-5x105个细胞加入500μl的Binding Buffer重悬细胞，然后加入5μl Annexin V-PE和5μl 7-AAD（BD）混匀，室温避光孵育15分钟，于流式细胞仪检测。

1.8 荧光素酶报告分析
用PCR法从293T细胞基因组DNA中扩增STAT5启动子序列，并将其克隆到psi-CHECK2载体（Promega）中，用lipofectamine 2000（Invitrogen）将GRAMD1A的siRNA（广州锐博）与报告载体共转染至细胞中，48小时后用Dual Luciferase Assay（Promega）试剂盒测量细胞中萤光素酶活性。

1.9 统计学处理
实验数据用均数标准差（x±s）表示，采用SPSS22.0进行统计学分析，两组数据采用独立样本t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。