天津医科大学陈雄文教授团队揭示钙信号紊乱是促进HFpEF发生发展的重要因素

射血分数保持的心力衰竭(HFpEF)是一种复杂的临床综合征，定义为左心室射血分数≥50%、静息或运动时左心室充盈压升高的心力衰竭(HF)。HFpEF发生的根本原因是多因素的，其细胞和分子机制尚不清楚。HFpEF的心脏表型包括心肌肥大、心肌纤维化、Ca²⁺信号通路障碍、炎症、线粒体和代谢缺陷。因此，需要具有HFpEF主要特征的动物模型来更好地理解HFpEF并确定新疗法的靶点。

目前，HFpEF动物模型包括Dahl/SS盐敏感大鼠、自发性高血压大鼠、主动脉缩窄小鼠和大鼠、衰老模型、主动脉束带猫、接受高脂饮食(HFD)的DOCA盐性猪和N^ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)加HFD小鼠。尽管这些多因素动物模型表现出人HFpEF的特征，但大多数临床前动物HFpEF模型均不符合HFpEF临床标准。

2023年4月1日，天津医科大学/美国天普大学陈雄文教授团队在Am J Physiol Heart Circ Physiol上发表了题为“Combining three independent pathological stressors induces a heart failure with preserved ejection fraction phenotype” 的研究成果。该研究构建了一种新的小鼠模型，该模型结合了三种病理刺激：1)心肌细胞(CM)特异性表达L型Ca²⁺通道(Cav) β2a亚基(β2a-Tg小鼠)引起的Ca²⁺内流增加，2)HFD，3)L-NAME (LN，一氧化氮合酶抑制剂)(称为3-Hit模型)。这种“3-Hit”小鼠模型诱导了稳定可靠的伴有CM肥大、心脏纤维化和M₂巨噬细胞数量增加的HFpEF表型。该模型可能有助于确定HFpEF的新治疗策略。

研究首先用正常饮食(WT-N)、或HFD和/或L-NAME (WT-HFD、WT-LN、WT-HFD-LN)喂养四月龄的FVB野生型(WT)小鼠。结果发现，4个月的HFD加L-NAME处理诱导FVB WT小鼠出现了心肌肥大，但没有诱导出明显的HFpEF表型。低水平CM特异性Cavβ2a过表达的转基因小鼠(β2a-Tg小鼠)显示胞浆CM Ca²⁺增加，CM肥大水平适中，且发生纤维化。基于此，作者用正常饮食(β2a-N)、或HFD和/或L-NAME (β2a-HFD、β2a-LN、β2a-HFD-LN；3-Hit)喂养四月龄的β2a-Tg小鼠。四个β2a组的数据表明，β2a-HFD-LN (3-Hit)小鼠的心脏病理表型最严重。

接下来，为了阐明用HFD和LN处理后WT小鼠和β2a-Tg小鼠之间的相似性和差异，以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC，一种心脏肥大调节剂)抑制剂伏立诺他(SAHA)的治疗效果，作者比较了五组(WT-N、WT-HFD-LN、β2a-N、β2a-HFD-LN和β2a-HFD-LN-SAHA)小鼠的数据。与WT-N小鼠相比，β2a-HFD-LN小鼠在4个月研究期间的死亡率明显更高(图1A)。与其他组相比，β2a-HFD-LN小鼠出现更严重的心肌肥大，表现为心脏重量(HW)、心脏/胫骨长(HW/TL)、心脏/体重比(HW/BW)和左心室壁厚度显著增加(图1B-D)。此外，与WT小鼠相比，β2a-Tg小鼠在4月龄时的左心室壁更厚(图1C-D)。ECHO分析显示，β2a-HFD-LN小鼠的LVEF保留(>50%)(图1E)，但LV纵向应变显著降低(<16%)(图1F)。组织学、ECHO和血液动力学测量显示，β2a-HFD-LN小鼠有明显的心脏舒张功能障碍，包括左心房直径(图1G)、左心房重量/BW(图1H)和E/e′比(图1I)显著增加，左心室舒张末期压力(EDP)增加(图1J)，左心室舒张时间常数(τ)增加(图1K)，以及dP/dtmin降低。与其他小鼠相比，ANP基因在β2a-HFD-LN小鼠中的表达显著增加(图1L)。这些结果均表明，心脏特异性β2a亚基过表达+HFD+L-NAME (3-Hit)三种刺激组合诱导了严重的HFpEF表型，可能导致过早死亡。

与WT-N组相比，SAHA治疗组的存活率没有明显下降(图1A)。此外，与β2a-HFD-LN小鼠相比，SAHA治疗导致HW、HW/BW、HW/TL和左心室壁厚显著降低(图1B-D)。SAHA治疗不影响LVEF(图1E)，但阻止了β2a-HFD-LN小鼠的纵向应变下降(图1F)。ECHO结果表明，β2a-HFD-LN-SAHA小鼠的左心房直径、左心房重量/BW和E/e′比显著降低(图1G-I)，表明左心室舒张功能改善。在SAHA治疗小鼠中观察到较低的EDP和τ (图1J-K)。SAHA治疗也导致ANP表达显著降低(图1L)。这些数据表明，SAHA治疗预防了3-Hit小鼠的早期收缩功能障碍和舒张功能障碍。

图1. 3-Hit小鼠模型出现明显的HFpEF表型，可以通过SAHA治疗来减轻

HDAC参与病理性心肌肥大。I类HDAC (HDAC1、2、3和8)和IIb类HDAC (HDAC6)激活可促进病理性心肌肥大，而II类HDAC (HDAC4、5、7和9)可抑制心肌肥大。与WT-N、WT-HFD-LN和β2a-N小鼠相比，β2a-HFD-LN小鼠的HDAC1、3、6和8明显更高(图2A)。SAHA治疗小鼠显示HDAC3表达显著降低，HDAC4和7表达增加(图2A和B)。与WT-N和WT-HFD-LN相比，β2a-HFD-LN小鼠的心肌细胞CSA增加最大，表明CM肥大最严重(图2C和D)。β2a-HFD-LN-SAHA小鼠的CM大小小于β2a-HFD-LN小鼠(图2C和D)。WT-N和β2a-HFD-LN小鼠凋亡心肌细胞数量(TUNEL染色)没有显著性差异(图2E和F)。而Von-Kossa染色显示，只有β2a-HFD-LN小鼠有更多的Ca²⁺沉积，提示CM坏死(图2C)。这些结果表明，SAHA治疗减少了HFD+L-NAME引起的β2a-Tg小鼠CM肥大和坏死。

图2. 3-Hit小鼠模型出现更严重的CM肥大和坏死，可以通过SAHA治疗来减轻

心脏肥大和坏死与HFpEF中的间质性心脏纤维化有关。作者计数了CD45⁺、CD68⁺和CD206⁺细胞，以估计巨噬细胞和M₂巨噬细胞的数量。与其他小鼠相比，β2a-HFD-LN小鼠心脏中CD45⁺单核细胞数量明显更多(图3A和B)，CD68⁺/CD45⁺巨噬细胞比例明显更高，CD206⁺ CD68⁺ M₂样巨噬细胞数量更多(图3C和D)。与β2a-HFD-LN小鼠相比，β2a-HFD-LN-SAHA小鼠心脏中CD45⁺单核细胞数量更少，CD68⁺/CD45⁺巨噬细胞比例更低，CD206⁺ CD68⁺促纤维化M₂巨噬细胞数量更少(图3A–D)。巨噬细胞可以产生一种有效的转化生长因子-β (TGFβ)。TGFβ mRNA在β2a-HFD-LN小鼠心脏中显著增加(图3E)。Smad2和3是已知的TGFβ信号转导下游的两个主要分子，其磷酸化水平(pSmad2/3)在β2a-HFD-LN小鼠心脏中也增加(图3F)。与β2a-HFD-LN小鼠相比，β2a-HPD-LN-SAHA小鼠中TGFβ的mRNA水平和pSmad2/3显著降低(图3E和F)。这些结果表明，在3-Hit HFpEF模型中，促纤维化M₂巨噬细胞激活TGFβ信号通路以刺激心脏成纤维细胞活化，从而促进纤维化，而SAHA治疗降低了纤维化。

图3. 3-Hit小鼠模型出现明显的心脏M₂巨噬细胞浸润和成纤维细胞活化，可以通过SAHA治疗来减轻

转录因子pSmad2/3可以上调α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，一种活化肌成纤维细胞的生物标志物)、胶原和纤连蛋白1 (FN1)的表达。β2a-HFD-LN小鼠心脏具有更强的α-SMA染色和更多的间质纤维化(图4A–C)。此外，在β2a-HFD-LN小鼠心脏中，FN1和胶原交联酶赖氨酰氧化酶(LOX)的mRNA水平增加(图4D和E)。SAHA治疗后，与β2a-HFD-LN小鼠相比，α-SMA染色强度降低，心脏间质纤维化以及FN1和LOX的mRNA水平降低(图4A–E)。

图4. 3-Hit小鼠模型出现严重的心肌纤维化，可以通过SAHA治疗来减轻

综上所述，本研究发现，三种独立的病理刺激(Ca²⁺内流增加、高脂饮食和L-NAME)共同诱导了明显的HFpEF表型。主要机制包括HDAC依赖性CM肥大、坏死、M₂巨噬细胞数量增加、成纤维细胞活化和心肌纤维化。在SAHA治疗的研究中显示了HDAC激活可以减轻HFpEF表型。总之，该研究中的“3-Hit”小鼠模型可能有助于确定HFpEF的新治疗策略。同期发表的评述文章“Calcium "stress" adds a third hit in driving heart failure with preserved ejection fraction”认为心肌细胞钙相关的病理应激导致HDAC分子功能变化和心肌肥厚，驱动高脂饮食联用NOS抑制剂L-NAME引起明显的HFpEF表型。

原文链接：

https://journals.physiology.org/doi/full/10.1152/ajpheart.00594.2022