Nature子刊：汤玮欣/赵明磊团队开发超迷你Cas12f系统，效率更高、脱靶性更低

CRISPR-Cas系统是原核生物（细菌和古菌）的用于防御噬菌体和外源遗传物质入侵的适应性免疫系统，之后被改造为新的基因编辑工具。最近，CRISPR技术已经走出实验室，在临床中修改患者的致病基因序列，为遗传疾病和癌症提供了强有力的解决方案。

在目前已鉴定的Cas蛋白中，spCas9（II-A型）和AsCas12a（V-A型）的应用最为广泛，然而，它们的蛋白都比较大（前者1368个氨基酸，后者1300个氨基酸），这超过了腺相关病毒（AAV）载体的装载极限，极大地限制了其在体内基因治疗中的应用。

近年来，V-F亚型CRISPR-Cas12f系统因其极小的体型（约400-700个氨基酸大小）和高特异性而备受关注。然而，现在报导的Cas12f系统在真核细胞中的编辑活性还相对较低，并且其较高的PAM识别特异性导致可靶向范围窄，从而限制了它们的进一步应用。因此，亟待开发新的高活性且可靶向范围更广的CRISPR-Cas12f系统。

2023年7月3日，芝加哥大学汤玮欣、赵明磊等在 Nature Chemical Biology 期刊发表了题为：An engineered hypercompact CRISPR-Cas12f system with boosted gene-editing activity 的研究论文。

该研究开发了一种工程化AsCas12f系统——enAsCas12f，其大小仅为SpCas9的三分之一，enAsCas12f显示出更高的DNA切割活性，高达野生型AsCas12f的11.3倍，并在人类细胞中广泛发挥编辑作用，在特定基因组位点上实现高达69.8%的DNA片段插入和缺失，还具有最低的脱靶编辑活性。enAsCas12f是迄今为止最高效、最紧凑的CRISPR系统之一，开启了基于CRISPR的基因编辑新领域。

近年来，科学家们开发了几种小型化Cas蛋白，例如CasX（Cas12e,986个氨基酸）、CasΦ（Cas12j，700-800个氨基酸）、Cas12f（400-700个氨基酸），以及IscB和TnpB（约400个氨基酸，被认为是Cas9和Cas12a的祖先）。其中，Cas12f由于其小尺寸和能够靶向切割DNA双链而备受关注。

2021年9月，上海科技大学季泉江团队开发了AsCas12f1（422个氨基酸）【2】。2023年4月，辉大基因杨辉团队开发了OsCas12f1（433个氨基酸）和RhCas12f1（415个氨基酸）【3】。

这几种小型化Cas12f都能够在哺乳动物细胞中实现基因编辑，具有很大的基因治疗前景。然而，将Cas12f系统作为基因编辑工具还有很大的改进空间，与Cas9和Cas12a相比，Cas12f系统切割双链DNA的效率较低，并且在靶向不同基因组位点时表现出很大的活性差异。

在这项研究中，研究团队通过理性设计来改造AsCas12f，从而获得了工程化的enAsCas12f蛋白，enAsCas12f对人类基因组造成DNA双链断裂（DSB）的效率可高达野生型AsCas12f的11.3倍。

研究团队还进一步解析了AsCas12f与sgRNA和靶标DNA的复合物冷冻电镜结构，分辨率为2.9Å，从而推进了我们对V-F型CRISPR系统的机制理解。在冷冻电镜结构的指导下，研究团队将sgRNA的长度从193nt缩短到了72nt，而不影响对DNA的靶向和切割活性。

研究团队还发现，enAsCas12f不仅编辑效率更高，而且通过GUIDE-seq评估显示，enAsCas12f具有最小的脱靶编辑效率。

总的来说，该研究开发了一种工程化Cas12f系统——enAsCas12f，其编辑效率可高达AsCas12f的11.3倍，而大小仅为SpCas9的三分之一。这种经过工程化改造的超紧凑Cas12f系统能够在哺乳动物细胞中实现高效和高特异性的基因编辑，这也是迄今为止最高效、最紧凑的CRISPR系统之一，enAsCas12f开启了基于CRISPR的基因编辑新领域。

论文链接：

1. https://www.nature.com/articles/s41589-023-01380-9

2. https://www.nature.com/articles/s41589-021-00868-6

3. https://www.nature.com/articles/s41467-023-37829-7