肉毒毒素的弥散度，是个伪概念！

      2012年的秋天，菜鸟笔者遇见了第一例上睑下垂的患者，依稀记得那个患者不幸中招的经历。患者去国内排名No.1的大咖（我们大多数人看着他的书长大）科室打肉毒毒素，打的是衡力。患者注射完当天晚上，回家看韩剧，由于剧情太感人，患者哭得一塌糊涂。次日早上醒来，就成这样了……

      笔者这种学术控，立刻查资料，“上睑下垂是因为肉毒毒素弥散到上睑提肌造成的”。查到这个资料，于是不明就里的笔者一本正经假装自己非常懂的样子去问了大咖大大，以期获得大大的认可。

      不想大大听完后，笑眯眯地对笔者说，“你想多了，那姑娘是自己哭得太厉害了，不停揉眼睛造成的……”拍拍笔者肩膀说，“不要傻读书，书上不一定对，书上的也是来源于实践的。”笔者瞬间觉得大大的形象真高大，帅得一塌糊涂！

      再看自己，真是遥想当年智商低,且看如今腰围粗！

      近年来，“弥散度”越来越多地被认为是区别肉毒毒素品牌优劣的重要评价指标之一。临床中和市场推广中，给了这个词太多的负面色彩。大多数人提到“弥散”这两个字，直接就联想到“不良反应”或者“并发症”。

      肉毒毒素的厂家们也纷纷引据经典实验，说明自己家的产品弥散度小，作用精准。我们先回顾实验和文献最多的保妥适：

      这里主要有三篇数据详实的质量较高的文献说明从二维的角度，保妥适的弥散度更小。

      再看衡力的文献报道：

      2012年也同样有一篇文献，报道了衡力的弥散度最小。

      很多医生问为什么不同的文章出来的结果是如此不同？

      还有医生流宽面条眼泪，仰天长啸“我好不容易跟顾客讲明白保妥适弥散度更小，结果这个文献又说衡力更小，那我怎么自圆其说啊？”

      又过了几天，有资深医生在微信群里提出异议：“保妥适的文献只是从二维平面的角度证明了保妥适弥散度小，但是弥散是立体的，3D的……”

      不想次日就在朋友圈读到了“衡力2012年的研究，选择在背部外侧的组织松弛处打保妥适，但是在组织紧致的背部内侧打衡力，这不足以说明衡力的弥散度更小。”

      真的感觉，肉毒毒素是个江湖，各种力量暗涌啊……

      不明吃瓜群众想问，真相到底是什么？

      笔者想给大部分的医生点赞，你们歪打正着说对了真相的90%！的确，不同的实验设计出来的结果就是不同的！

      也想拥抱流泪的迷茫的被文献转晕的其余医生，别哭，你不是一个人！估计也不太有人讲得清楚弥散度到底是什么……

      想明白这个问题，还是要回到“弥散度”这个概念本身。

      弥散，所有药物的常见“运动方式”之一，是个中性的词。

      我们知道肉毒毒素的特点之一就是在局部起效，即放松特定的目标肌肉。故，在目标肌肉的范围之内其作用的弥散，不是个贬义的动词，而是一种方式和手段。

      Back to early days，当EMG等辅助设备没有被发明使用的时候，对于一些深部的精细的小肌肉，我们用徒手定位，是很难保证毒素一定是打到目标肌肉的，因此这个时候的“弥散”，不是跟“不良反应”那么相关，反而因为技术的局限性和工具的缺乏，有时候需要“弥散”才能让肉毒毒素渗透到目标肌肉。例子就是笔者第一次打保妥适的时候，记得印象特别深刻的是，医生告诉我打完后要反复皱眉，这样才能确保药水均匀地被吸收。

      我们来看看历史上，弥散是如何引起医生们关注的。

      先前的经典文2014年《肉毒毒素是不可互换的》是这样描述的：主要的三种肉毒毒素产品在批准的剂量下通常具有良好的耐受性，发生的不良事件通常归因于从预期区域到附近解剖结构的弥散或扩散。我们不难看出，这里的弥散，指的就是肉毒毒素在不该起作用的非目标的区域起了作用。

      在肉毒毒素的百年历史中，涉及后注射肉毒毒素生物运动的术语在文献中也有所不同。

■  Cliff等人用的词是“migration”（迁移）;

■  Pickett等人用的是“ diffusion and migration”(弥散和迁移);

■ Walker和Jankovic教授则用了“spread”（扩散）; 

■ Ramirez-Castaneda等人把“spread ”分成了三个情况，即“local physical movement”（局部物理运动）、 “diffusion to a more microscopic movement of a soluble molecule's dispersion by passive transport”（通过被动转运扩散到可溶性分子的分散体的更微观运动）、以及“migration to distant spread”（迁移到远距离传播）。

■  而FDA这种药监部门则侧重于临床现象，就是用距离来判定：扩散、区域扩散或（局部）传播来指连续肌肉的局部效应；远距离传播是指远离注射部位的区域与非连续区域的区域注射。

      因此不难看出，弥散从范围和距离上看，可能更微观一些，而“扩散”一词，现在用得更多。

      各路学者们都已经使用不同的模型和技术来研究肉毒毒素的弥散，一些研究已经基于蛋白质表达或电生理测量来检查肉毒毒素局部活性的区域，而其他研究已经评估了更多的宏观效果，例如在注射到肌肉或真皮中之后发生在人类中的相邻肌肉的弱化和脱水的卤素。

      由于允许药效学评估，因此可用于评估可能说明一些产品特征的差异。

      这些研究表明，注射后肉毒毒素的局部扩散取决于各种因素，因此决定“弥散度”、“弥散系数”、“安全窗”等推广中常见术语的，应该是一个数据模型，包含很多很多变量，like：

      想正确理解弥散度，就要从根本上去理解肉毒毒素注射入肌肉后是如何发生一系列的运动的。

      2015年，肉毒毒素领域目前世界排名第三的大咖Mark Hallet发表了一篇《关于肉毒毒素作用的时机，起效和持续时间以及影响它们的临床方法》，这文提出了以下观点：

      1. 肉毒毒素注射后，被摄入神经末梢，注射到终板区域是最佳的。

      上文提到的运动终板（Motor End Plate），就是神经肌肉接头，是一种负责将神经的电信号传递给骨骼肌的特殊结构。如下图，红色圈圈区域：

      肉毒毒素注入肌肉后，它驻留在细胞外空间，必须被带进神经末梢才可以起作用。由于此过程仅在运动终板上发生，所以注射越接近运动终板，肉毒毒素的作用则越明显。运动终板通常位于肌肉纤维的中间，但由于纤维在不同肌肉中的组织不同，所以除了解剖学知识之外，有时候我们要借助工具来引导注射器。肉毒毒素主要由对流分布，几乎不扩散。而那些没有被摄入运动终板的肉毒毒素则会进入全身循环，可能有轻微的全身效应。

      关于肉毒毒素在运动终板的作用是慢慢起效的，初始几天发生弱化不明显，峰值出现在几周左右。2个月后效果消退，强度恢复正常一般3个月。

      下图是肉毒毒素作用的机制：

      如上所述，肉毒毒素的作用机制和步骤是众所周知的，然而影响每个步骤发生时间的因素尚未清楚。

      肉毒毒素开始是通过对流分布在肌肉腹部，即由流体体积和注射力决定的流体的大量运动。随后可能会扩散；也就是说，通过由浓度梯度和分子大小确定的布朗运动从初始位点扩散。肌肉之间的筋骨界限似乎不是重大障碍（Shaari et al，1991），所以附近的肌肉可能会受到针位精确度和注射体积的影响。而扩散所需要的时间可能并不是很长，因为处于细胞外的肉毒毒素是不断被机体代谢的。

      关于肉毒毒素随后的扩散，2014年，由Elwischger等人发表了《MRI观察肉毒毒素在肌肉内的分布》一文中，有很多值得我们思考的地方。

      该项研究的目的是为了了解肉毒毒素在肌肉内分布的时空动态变化及调解因素，如注射容积和注射后运动。这样一来就还原了肉毒毒素注射后的动态变化。

      实验用弹丸式注射1 ml 经过氯化钠溶解后的肉毒毒素在4例患者（痉挛性肱二头肌），右侧1 ml NaCl和左侧2 ml NaCl注射于6例健康人的肱二头肌，注射后伴随或不伴随持续肌肉锻炼，注射期间使用矢状位平衡式快速梯度回波(BFFE) MRI成像。同时使用T2加权相和弥散张量成像(DTI)评估细胞外液分布。实验结果显示额外的肌肉活动不会改变弥散模式或药液分布，肉毒毒素沿着肌肉纤维的长轴分布，在10分钟内变化不大。肉毒毒素在痉挛的肌肉与正常肌肉的分布体积相似，但可能略小。

      事实上，2003年就有学者在小鼠肌肉中模拟了肉毒毒素和辅助蛋白分别在肌肉中分布体积的变化（Tang-Liu DD, Aoki KR, Dolly JO, de Paiva A, Houchen TL, Chasseaud LF, et al. Intramuscular injection of 125I-botulinum neurotoxin-complex versus 125I-botulinum-free neurotoxin: time course of tissue distribution. Toxicon. 2003 Oct;42(5):461–9.）。这个实验真的厉害了，因为它把纯肉毒毒素和带有辅助蛋白的肉毒毒素复合体对照了弥散度。

      从下图中我们可以看见，I组就是带有辅助蛋白的肉毒毒素组，Ⅱ组则是不带有辅助蛋白的肉毒毒素组。图A是注射即刻，图B是注射后2小时，图C是注射后6小时，图D是注射后12小时。

      实验结果表明了，两组绝大部分都保持在了原始的注射部位，并且两组扩散的模式是非常相似的。

      2009年，Carli L, Montecucco C, Rossetto O.等人发表了《小鼠腿注射不同型肉毒毒素制剂的扩散试验》，试验中评估了Botox、Dysport和Xeomin三种品牌的毒素。这个实验主要使用一种基于神经细胞粘附分子（N-CAM）来表达高度敏感的测试肌肉。

      吃瓜看官表示，请说人话！

      其实就是用这个工具来测，看注射后的一段时间内，肉毒毒素在肌肉中的分布变化。

      上图是用间接免疫荧光染色法看这个N-CAM来测定肉毒毒素分布的效果。图A是注射了Botox的肌肉纤维切片图，图B是对侧肌肉，图C是手术方法去神经，图D是注射生理盐水。在证实这个N-CAM是有效的之后，他们开始了实验，分别用三种不同的肉毒毒素对小鼠的胫骨前肌进行注射，7天后看相邻的肌肉比目鱼肌、腓肠肌、股四头肌看弥散程度，结果见下图：

      然后再观察不同品牌的肉毒毒素在胫骨前肌注射后，第14、21、30、60天的肉毒毒素作用效力的变化，结果见下图：

      用光密度分析法分析标记物的含量，结果如下：

      综上，证据似乎相当清楚，肉毒毒素的分布主要由对流决定，实际上是通过对流和注射量来确定的。很难找到关于肌肉残留肉毒毒素的研究，事实恰恰是很多研究证实了肉毒毒素在肌内注射后是多么迅速地被代谢掉的。

      地高辛的一项研究表明，肉毒毒素的机体内循环的半衰期为仅为4分钟（Hess P, Muller P. Extracellular versus intracellular digoxin action on bovine myocardium, using a digoxin antibody and intracellular glycoside application. J Physiol. 1982 Jan;322:197–210.）。

      一项评估pH值为6.0至7.6的A型肉毒毒素（900kDa复合物）的实验室制备的研究发现，在大于7.0的pH值下，辅助蛋白和神经毒素解离发生在不到1分钟内。

      因此，现在我们明白了，任何肉毒毒素注射后的吸收都是在很短的时间之内。请注意，笔者这里指的时间不是指“肉毒毒素起效或者持续的时间“，而是微观地去看肉毒毒素注射后的分子运动，看肉毒毒素进入运动终板的这个短瞬的时间。

      而进入了整体循环代谢的未被吸收的肉毒毒素，则有可能在身体其他地方的其他肌肉或其他突触前的终端发生作用。没有发生全身的效应的原因，是因为与身体的大小相比，肉毒毒素含量较少。目前不能确定肉毒毒素不会被其他部位吸收，但有研究显示，这些肉毒毒素可能被肝脏代谢（Simpson L. The life history of a botulinum toxin molecule. Toxicon. 2013 Jun;68:40–59.）。

      真的没有想到，一个“弥散度”背后有这么多学问，牵扯出这么多的问题来，并且很多未知的领域等着我们去一起探索。但愿笔者的解读可以为同样热爱肉毒毒素的你，解惑答疑。

      不要再去纠结“弥散度”，除非你想跟笔者一样一半时间泡在实验室。

      退一万步说，如果你真的是处女座式地纠结，在剂量不变的情况下，通过增加浓度、减少注射液体体积以及控制注射速度等方法，来控制弥散度吧~~