PNAS：单细胞测序技术揭示衰老个体中特异性、高频率和功能性mtDNA突变广泛存在

已有研究表明，线粒体DNA（mtDNA）突变的发生率比核DNA高得多。由于整个mtDNA基因组约95%是编码区，mtDNA突变可能导致线粒体功能下降、细胞活性改变甚至导致疾病。除了众所周知的线粒体疾病，例如神经源性衰弱伴共济失调和色素性视网膜炎（NARP），mtDNA突变也可能导致与年龄相关的复杂疾病，如2型糖尿病、神经退行性疾病和多种癌症。

大多数报道的与人类疾病相关mtDNA突变是异质性的，这意味着突变体和野生型mtDNA在细胞或组织中共存，因此必须在单细胞水平上量化mtDNA突变及其相关的致病效应，以了解mtDNA突变的真实分布。单细胞测序可在相关研究中发挥重要作用。但大多数现有的单细胞mtDNA测序方法使用昂贵的商业试剂盒进行单细胞mtDNA扩增和下一代测序（NGS）文库制备。此外，虽然单细胞测序可以帮助识别 mtDNA突变以进行谱系追踪，但不能揭示整体单细胞mtDNA突变负荷。这就提出了对单细胞mtDNA具有成本效益和靶向测序方法的需求。

近日，粤港澳大湾区精准医学研究院（广州）顾正龙教授团队开发了一种新型、具有成本效益的人类mtDNA靶向测序方法，称为单细胞多重探针靶向扩增测序（scSTAMP），用于评估细胞群体样本中的mtDNA突变。研究结果表明scSTAMP在检测mtDNA单核苷酸突变时具有高靶率和高敏感性。同一个体不同细胞之间的mtDNA突变可能随着年龄增长，并且可能是组织或生物体水平线粒体功能下降的重要原因。该研究结果发表PNAS上，文章题为“High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level”。

文章发表在PNAS上

scSTAMP是一种具有成本效益的靶向测序方法，可用于评估大块细胞群体样本中的mtDNA含量和突变。scSTAMP使用46对单链寡核苷酸探针，通过延伸-连接（EL）反应捕获整个人类mtDNA基因组，然后对其产物进行PCR扩增、文库纯化和大规模测序。为了扩展scSTAMP进行单细胞线粒体基因组的评估，研究团队在EL捕获反应前加入了PCR扩增步骤，以产生足够的mtDNA分子用于靶标捕获。整个mtDNA基因组在一次反应中直接从单细胞裂解物扩增为两个重叠的片段，得到的扩增子经scSTAMP处理生成测序文库（图1）。

图1：scSTAMP和验证的实验工作流程。

研究团队对来自一名76岁健康女性的B淋巴细胞和单核细胞进行了分析。结果显示，在单细胞水平普遍存在mtDNA的高频致病性突变，超过50%的细胞携带至少一种mtDNA突变，变异等位基因频率（VAF）超过20%，B淋巴细胞和单核细胞平均携带这种突变分别为0.658和0.712。

研究人员在B淋巴细胞的416个mtDNA位点上，鉴定出473个变异等位基因频率（VAF）超过20%的突变，在单核细胞的439个位点鉴定出505个类似突变（图2）。此外，突变数量与细胞中位覆盖深度之间没有显著相关性。在所有位点中，转化突变位点分别为97.37%和96.83%。G>A和T>C是两种主要的突变类型。

图2：单细胞mtDNA突变很普遍。

研究数据显示，mtDNA蛋白质编码基因突变是最常见的。在蛋白质编码基因中，包括271个位点的312个B淋巴细胞突变（65.1%）和264个位点的328个单核细胞突变（60.1%）（图3）。第二常见的突变类型是rRNA/ TRNA编码基因：rRNA编码基因突变在B淋巴细胞中有84个（20.2%）。总的来说，mtDNA蛋白质编码和TRNA/RRNA编码突变位点占所有识别位点的90%以上。虽然D-loop在人群中被认为是高度可变的，但在B淋巴细胞中，研究团队仅在19个位点（4.6%）观察到20个突变；在单核细胞中，仅在14个位点（3.2%）观察到23个突变。

图3：单细胞mtDNA突变在功能上很重要。

综上所述，该研究团队开发了一种具有成本效益的mtDNA靶向测序方案scSTAMP，并通过实验验证了其可靠性。研究结果表明，超过50%的细胞携带至少一种mtDNA突变。令人惊讶的是，在两个细胞群中，超过20%的突变具有超过90%的VAF。该研究在单细胞水平上系统地评估了mtDNA突变的模式和动态，不仅为线粒体遗传模式研究提供了新的方法，同时也揭示了衰老细胞中特异性、高频率和功能性mtDNA突变广泛存在，提示潜在致病的mtDNA突变有可能促进细胞及个体的衰老。