清华大学李雪明研究组揭示细菌II型分泌系统外膜复合物的分泌机制

2017年1月9日，清华大学生命科学学院李雪明课题组在《Nature Structural & Molecular Biology》杂志在线发表题为《细菌II型分泌系统的分泌素结构及其工作机制》（Structural Insights into Secretin Translocation Channel in Type II Secretion System）的研究论文，该工作通过冷冻电镜的研究手段首次揭示了细菌II型分泌系统外膜复合物GspD分泌素通道的原子分辨率结构以及通道的半开放状态结构，结合相应的生化实验，阐述了底物通过II型分泌系统分泌素的分泌机理。

　　革兰氏阴性菌通过一系列不同类型的分泌系统向胞外或者其他细胞分泌各种底物，包括离子，小分子（如抗生素），大分子物质（如毒性蛋白，DNA）等，这些分泌出的底物大多都与人类健康息息相关。其中的II型分泌系统（T2SS）分泌的底物主要是折叠好的成熟蛋白质，通常是与疾病直接相关的毒性因子或效应蛋白，其中比较熟知的有霍乱毒素、肠毒素，以及外毒素A。T2SS的外膜复合物分泌素GspD是分泌底物通过细菌外膜的最后通道，先前只有N末端几个结构域的晶体结构，以及低分辨冷冻电镜结构。长久以来，缺乏高分辨率的结构信息来帮助理解通道的整体构造及相应的底物分泌机理。

　　该工作通过冷冻电镜单颗粒重构的方法首次解析了全长分泌素GspD复合物约3 Å分辨率的分子结构，包括Escherichia coli 来源的和Vibrio cholerae来源的两种复合物。这不仅是T2SS外膜复合物第一个全长的原子分辨率结构，也是分泌素家族的第一个全长的原子分辨率结构。该工作首次揭示了GspD复合物具有十五重对称性（C15），不同于之前报道的十二重对称(C12)结构模型。该分子结构清晰地展示了蛋白N端结构域形成的环形通道结构，澄清了之前通过晶体结构推测出来的不准确结构模型。该工作还首次观察到了一个由C端结构域形成的新颖的双层β桶构造，其中每层至少有60根反平行的β-strands构成，是目前结构已知的最大β桶构造的通道。这一巨大的桶形结构由外表面上结合的S结构手把手围绕起来，发挥稳定双层β桶的作用。通过在中心通道的边缘区域点突变的方法将非常保守的甘氨酸突变成丙氨酸，使关闭的分泌素通道转变成到一个半开放的状态，通过进一步的结构和功能分析，本工作阐述了底物通过分泌素GspD通道的分泌机理。

分泌素GspD蛋白的冷冻电镜结构和通道开关的分子机制

　　（a）GspD复合物的电子密度图和原子模型图。上半部分为Escherichia coli 来源的GspD，下半部分为Vibrio cholerae来源的GspD，右半部分为电子密度图和原子模型叠加在一起的顶视图。（b）半开放状态的结构与野生型的对比剖面图。电子密度图低通滤波到7Å。（c）基于得到的结构和生化验证提出的通道开放分子模型图。黑色圆圈表示中间门控起转折的关键甘氨酸。

　　清华大学生命学院李雪明研究员和浙江大学的朱永群教授为本工作的共同通讯作者。清华大学生命学院三年级直博生严照峰和PTN项目三年级博士生尹孟为本文共同第一作者。浙江大学博士生徐丹丹也参与了这项研究工作。该工作的冷冻电镜数据采集在国家蛋白质科学设施（北京）的清华大学冷冻电镜平台完成，数据处理在国家蛋白质科学设施（北京）清华大学高性能计算平台完成。该工作获得了生命科学联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心、国家自然科学基金委面上项目和科技部重点研发计划的经费支持。