Stem Cell Research & Therapy：联合移植技术让基因治疗成为A型血友病更具前景的治疗方法

目前A型血友病的护理标准是蛋白质替代疗法，需要频繁输注FVIII蛋白质浓缩物。尽管这些疗法带来了预期寿命和生活质量的益处，但高成本、终身输注的需要以及不能保持稳定的凝血因子水平使它们远非理想。

Jessica Morris每周给儿子Landon注射三次凝血因子（图片来源：NPR）

A型血友病源于F8基因突变的单基因缺陷，因此基因治疗被认为是一种很有前景的替代方案。许多候选基因疗法，如Sangamo Therapeutics和辉瑞（Pfizer）的SB-525、uniQure的AMT-180、BioMarin的valoctocogene roxaparvovec（BMN 270）正在开发和临床测试中。它们都基于称为腺相关病毒（AAV）载体的病毒载体，旨在将F8基因的功能形式递送至患者的细胞。但是基于AAV的基因疗法的长期有效性仍然是未知的，并且约三分之一的患者由于先前与AAV病毒接触而不适合，这意味着它们具有产生针对载体的免疫应答的潜力。

另一种可能性是使用基于细胞的基因疗法，其中首先将功能性F8基因引入患者体外的靶细胞中，然后将那些工程化细胞移植到患者体内。

近日，加州大学戴维斯分校的研究人员为基于细胞的A型血友病基因治疗提供了有希望的临床前证据：基于基因工程产生功能性凝血因子VIII（FVIII）的内皮祖细胞和干细胞的联合移植可实现稳定和长期的治疗，减轻患有A型血友病样疾病的小鼠的症状，即缩短出血时间。

寻找合适的移植细胞

该研究可能对A型血友病患者具有重要意义，因为基于细胞的疗法有望应对这种出血性疾病，但由于治疗细胞的长期植入不足而阻碍了成功的治疗。

对于A型血友病治疗，将循环凝血FVIII水平增加至正常值的1％以上可以显着降低自发性内出血的风险。长期以来，FVIII生物合成的主要细胞来源一直存在争议。20世纪60年代和80年代的肝移植研究表明，肝脏是FVIII的主要来源。早期的证据表明，肝细胞是肝脏中FVIII表达的唯一来源，但后来证明它主要是LSECs（肝窦内皮细胞）。除肝脏外，还显示来自其他器官如肺、心脏、肠和皮肤的内皮细胞也产生FVIII。因此，内皮细胞似乎是该疾病基因治疗的合适候选者。

ECFC（内皮细胞集落形成细胞）是一组具有高增殖能力的细胞，在成人外周血中稀有（约0.05-0.2 cells/ml），但在人脐带血中高度丰富（约2-5 cells/ml）。大量研究表明，从脐带血中获得的ECFC成熟程度较低，在体外和体内具有高增殖潜力。因此，脐带血可能是比骨髓更好的ECFC来源。

数据显示，脐带血衍生的ECFC不表达可观量的FVIII。为了增加FVIII分泌的量，在该研究中，研究人员使用慢病毒转导这些细胞以过表达FVIII。他们使用两种慢病毒载体转导ECFC，一种是编码BDD-F8的pCCLc-MNDU3-BDD-FVIII-PGK-NEO-WPRE，另一种是编码荧光素酶和GFP（绿色荧光蛋白）的pCCLc-MNDU3-LUC-PGK-EGFP-WPRE用于细胞追踪和植入分析。流式细胞术检测转导率为87.53%。

基于细胞的疗法另一潜在困难是，移植的细胞在患者体内产生凝血因子的时间太短。

为了改善移植的ECFC的植入，该研究已经考虑了两种或更多种细胞的联合移植。先前的研究表明，与单独的ECFC相比，ECFC与MSC（间充质干细胞）的共同移植改善了血管形成和植入。MSCs通过作为血管周围前体细胞发挥功能，有效地稳定体内新生血管。ECFC和MSCs的共同移植显着促进心血管疾病、脑血管疾病和骨再生过程中的组织恢复。

据作者所知，他们是第一个研究ECFCs和PMSCs（胎盘间充质干细胞）联合移植治疗A型血友病的研究机构。该项研究中，他们发现ECFCs在免疫缺陷小鼠中单独移植或与PMSCs一起移植时表现出持续植入。MSCs在移植后的较晚时间点显着增强ECFC植入。

更有效植入新生小鼠体内

首先，为了研究成年动物中移植细胞的细胞存活和移植，研究人员将下列三组细胞肌内注射到12周岁NSG小鼠的左后肢中，通过IVIS成像系统监测细胞存活和植入。

ECFC组：GFP/荧光素标记的ECFC

PMSC组：GFP/荧光素标记的PMSC

ECFC/PMSC联合移植组：Td-番茄标记的PMSC和GFP/荧光素标记的ECFC

在移植后的前3周，所有三组中的生物发光信号显着降低。移植后第3周，PMSC组的信号达到基线，并且在24周的整个研究期间未显示任何增加。相比之下，ECFC组和ECFC/PMSC联合移植组也显示移植后前2周信号强度降低，但在移植后持续24周的时间段内显示出稳定的高于基线的植入率。

（图片来源：Stem Cell Research & Therapy）

下一步，研究人员采用相同步骤将三组细胞移植到新生NSG小鼠（3-5天龄），以研究细胞存活和植入中的差异。与成年小鼠一样，在新生小鼠中使用相同的实验设置和细胞数。移植后监测动物26周。

移植后的前3周，细胞存活率降低，并且这三组之间的细胞保留没有显着差异。移植后12周，PMSC组的生物发光信号连续降低并达到基线；相反，ECFC组中的生物发光信号保持相同的强度，在整个26周期间显着高于基线；在联合移植组中，强度在4至26周时间段内维持，并在20周时最高，表明移植细胞的长期植入和增殖。

与PMSC组相比，ECFC组和联合移植组的信号强度显着更高。在16周和20周时，联合移植组的信号显着高于ECFC组（p <0.01和p <0.001）。

（图片来源：Stem Cell Research & Therapy）

进一步的比较发现，在移植后4至24周期间，新生小鼠在联合移植组中具有比成年小鼠更高的生物发光信号，而在ECFC组和PMSC组中，没有显着差异。数据表明，对于长期的细胞移植，新生儿期联合ECFC和PMSC进行细胞移植或优于成人期。

联合移植：显着减轻A型血友病小鼠出血症状

为了评估ECFCs和PMSCs的联合移植是否对治疗A型血友病有治疗效果，研究人员将3×10^6个ECFCs和2×10^6个PMSCs皮下移植到每只新生HA小鼠（出生后2周）的左右后肢。

联合移植显着减弱A型血友病新生小鼠的出血症状（图片来源：Stem Cell Research & Therapy）

移植后一周，生物发光成像显示移植的细胞保留在所有5只HA小鼠中。随后，进行尾夹测定以检测这些处理小鼠的失血，并与对照未处理的HA小鼠和对照正常C57BL/6小鼠进行比较。对照C57BL/6小鼠和对照HA小鼠的失血量分别为131.5±13.3μl和562.13±19.84μl。ECFC/PMSC联合移植的HA小鼠失血量为155.78±44.93μl，这与正常C57BL/6小鼠相似，并且显着低于对照HA小鼠。

RT-PCR分析进一步证实了F8在注射部位的小鼠组织中的表达，而对照HA小鼠没有可检测的F8表达。数据表明，ECFC和PMSC的联合移植显着减弱了HA小鼠的出血症状。

“这项研究表明，在新生儿中ECFCs与PMSCs的联合移植是实现稳定、长期植入的潜在策略，对A型血友病的基因治疗具有很大希望。”研究人员总结道。

基于造血干细胞的基因疗法已经在β-地中海贫血症、镰状细胞贫血症和一些免疫缺陷疾病中显示非常出色的疗效，针对血友病的AAV基因疗法也获得了相当大的成功，如果可以进一步拓展适用人群，那么将能造福更多的患者，有望找到最适合每个个体的治疗方式。

原始出处：Kewa Gao, Priyadarsini Kumar, Elizabeth Cortez-Toledo, et al. Potential long-term treatment of hemophilia A by neonatal co-transplantation of cord blood-derived endothelial colony-forming cells and placental mesenchymal stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 22 January 2019