我国学者首次证实，人类成熟红细胞具有大片段DNA，并且具有潜在的疾病诊断价值
2023-01-07 生物世界 生物世界 发表于上海
哺乳动物的成熟红细胞的在发育过程中会通过一系列的过程将细胞核和线粒体排出，而DNA仅存在于细胞核和线粒体中，所以长久以来，红细胞中是否依然含有DNA片段尚没有非常明确的直接证据。红细胞主要功能是作为氧
哺乳动物的成熟红细胞的在发育过程中会通过一系列的过程将细胞核和线粒体排出，而DNA仅存在于细胞核和线粒体中，所以长久以来，红细胞中是否依然含有DNA片段尚没有非常明确的直接证据。红细胞主要功能是作为氧气、二氧化碳及其他的代谢产物运输的载体，但是也有很多研究从不同的角度揭示了红细胞同样参与到各种免疫反应中，在病原微生物的识别、免疫细胞的激活中扮演着重要的角色。
癌症的早期诊断一直是研究的热点和难点，科学家们尝试利用各种标志物以无创的方式尽可能准确地实现各类癌症的液态活检。2011年，Nilsson等人报道了血小板会因为受到早期肿瘤的影响而改变其RNA的表达模式，展现了其在癌症诊断方面的潜力。红细胞与血小板在很多方面有着非常类似的性质，尤其是考虑到肿瘤细胞早期发展阶段会大量招募红细胞为其生长提供支持，极有可能影响到红细胞本身并使其成为新的诊断目标。
2023年1月4日，南京大学医学院的陈奇涵博士以及中国药科大学生命科学学院梁宏伟博士协同北京协和医院梁乃新医生和南京鼓楼医院的焦子宸医生等研究人员，在 Advanced Science 期刊上发表了题为：Mature Red Blood Cells Contain Long DNA Fragments and Could Acquire DNA from Lung Cancer Tissue 的研究论文。
该研究首次证实了人类成熟红细胞中含有长片段的DNA，以及红细胞在癌症早期诊断中潜在的应用价值。
成熟红细胞中存在长片段DNA
研究者首先建立了从外周血中分离成熟红细胞的流程，并通过显微镜观察、流式细胞仪鉴定等手段证实了其中并没有其它细胞残留。通过DAPI染色，可以看到红细胞胞质中存在DNA并且成弥散状，而PBMC的DNA存在于明显的细胞核结构中。另一方面，红细胞仅会被能够通过细胞膜的DAPI染料染色，而不会被不能通过细胞膜的PI染料染色，暗示着DNA并非位于红细胞的膜表面而是胞质内部。
由于红细胞中含有大量的血红蛋白和铁离子，研究者通过改良的提取方法成功地获得了红细胞包含的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳及安捷伦2100芯片的结果，可以清楚地看到红细胞中的DNA大于1000bps并且主要为数万bps以上的大片段，但是明显小于从有核细胞（A549及PBMC）中获得的DNA片段，也进一步证实了这些DNA不是来自于其他有核细胞的污染。通过原子力显微镜，我们能够直接看到红细胞中的DNA呈现线性，并且从～1000bps到更长不等。之后，研究者借助NGS获得了这些DNA的信息，发现这些DNA片段确实是来自于人而非入侵或者污染的微生物，并且能够覆盖染色体和线粒体基因组的绝大部分区域。
正常人和肺部良恶性结节患者的红细胞DNA存在明显差异
在此基础上，研究者收集了更多的红细胞样本，包括正常人的、肺部有良性结节的以及有恶性肿瘤的患者。与之前的发现一样，所有的样本中均存在大片段的DNA。基于NGS的结果，研究者发现来自这三类不同人群的样本在片段拷贝数变化及缺失方面具有很多共同点和特点。例如，来自三例正常人红细胞的DNA在各染色体上的分布非常均匀，而在两类结节患者中则明显呈现出更大的拷贝数变化波动。此外，在例如与癌症发生有密切关系的APOBEC脱氨酶家族成员APOBEC3A和3B所在的区域也在部分结节患者中出现了片段的缺失。研究者进一步将染色体划分成1000bps的框进行拷贝数的统计，并且选取了四千多个在样本间有差异的框进行聚类。从结果看，健康人与结节患者间也存在明显的差别。
成熟红细胞能够从肿瘤细胞中获得DNA片段
埃德蒙·洛卡德（Edmond Locard，1877-1966）博士是法国著名的法庭科学家和侦查学家，他在20世纪初提出了著名的物质交换定律，即犯罪分子会在犯罪现场留下物质并带走物质。研究者以此为启发，猜测红细胞与早期肿瘤细胞接触的过程中，给肿瘤细胞提供氧气等物质，同样有可能带走物质。考虑到肿瘤细胞的基因组并不稳定，伴随频繁的断裂、重组、修复而产生DNA碎片，这些碎片有没有可能被红细胞带走呢？
为了证明这一猜想，研究者首先构建了体外共培养的系统，将红细胞单独培养及与A549和H1975两种肺癌细胞系共同培养，并且在不同时间点重新收集分离红细胞。在共培养的过程中研究者设计了两种方式，一种直接接触共培养，另一种则利用transwell透膜分隔开两种细胞但是允许外泌体及cfDNA等自由通过。之后，红细胞中的DNA被提取并检测细胞系带有突变的区域。从结果来看，在短暂的直接接触之后，红细胞即获得了对应细胞系的突变DNA片段，而非直接接触组则不会。通过电子显微镜的观察，红细胞也并没有在共培养前后发生更多的形变，进一步说明获得的DNA片段并不是结合在红细胞表面的，而是进入了红细胞内部。
之后，研究团队北京协和医院和南京鼓楼医院开展了一个小规模的临床研究，尝试在早期的肺癌患者中检测三个最常见的突变位点，并与后续手术之后的肿瘤组织进行比较。这些患者的样本同时也送给第三方机构利用cfDNA进行突变的检测，但是由于病人还处于早期肺癌阶段，并没有获得突变的信息。从结果看，利用红细胞的DNA进行突变的检测具有极高的灵敏性和包容性。此外，值得注意的是，一位患者在进行肺部肿瘤切除手术2个月后依然能够在其红细胞的DNA中检测到被切除肿瘤包含的突变。考虑到红细胞的寿命约3-4个月，红细胞中这些来自肿瘤的DNA片段的留存时间可能会远长于血清中cfDNA。
总的来说，这一研究拓展了人们对于红细胞的认知，揭示了红细胞可能更多的参与到免疫反应中。另一方面，基于红细胞的新型液体活检技术在早期癌症筛查和恶性肿瘤诊断领域具有非常大的应用潜力。
论文链接：
http://doi.org/10.1002/advs.202206361
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