Nature BME:一种未检测到RNA和DNA脱靶突变的肝细胞内胞苷碱基编辑方法

很大一部分遗传病是由单核苷酸突变引起的，这种突变有可能被RNA可编程脱氨酶（被称为碱基编辑器（BEs））当作为靶点。BEs通过尿嘧啶和肌苷中间产物，通过单链DNA特异性胞嘧啶或腺苷脱氨酶，使单个C·G到T·A或A·T到G·C碱基对转化，这些酶与催化受损的Cas9融合。 这些碱基对转换独立于双链DNA断裂或同源性定向修复，并且能够在有丝分裂后组织中在体内进行有效编辑。最近的体外研究表明，胞苷碱基编辑（CBEs）可以在细胞中引起成千上万个sgRNA独立转录组的广泛脱靶突变，在诱导多能干细胞和细胞期胚胎中引起数百个全基因组的脱靶突变。总之，这些数据表明，CBE的表达可能会对患者的应用带来相当大的风险，本文评估体内体组织中胞嘧啶碱基编辑过程中的脱靶效应，并建立一种使CBE表达持续时间最小化的传递方法。

为了评估CBEs在体内的非靶向脱氨作用，本文重点研究了Pahenu2小鼠苯丙酮尿症模型，该模型可以通过AAV介导的金黄色葡萄球菌（Sa）KKH–CBE3系统进入小鼠肝脏来治愈。使用双AAV-intein分裂系统将其系统引入Pahenu2小鼠中，以纠正外显子中引起疾病的T-to-C突变。首先使用RNA测序评估转录组范围的脱靶去氨作用。将表达SaKKH–CBE3的质粒转染到HEK293T细胞中导致平均39000个C-to-U转换。为了确定在肝内胞嘧啶碱基编辑过程中是否发生类似的转录组范围的脱靶突变率，使用AAV8将SaKKH–CBE3系统地引入Pahenu2小鼠。8周后，当AAV载体的转基因表达达到峰值时，从肝脏提取RNA，并使用RNA序列分析。尽管观察到23%的靶点编辑，与未处理的对照组相比，转录组范围的C-to-U转换没有增加。

胞嘧啶编辑优先发生在处理过的HEK293T细胞中ACW的典型APOBEC一致序列内，但在处理过的小鼠肝脏中不发生。有趣的是，当比较不同样本中的SaKKH-CBE3表达时，观察到HEK293T细胞的转录水平比肝脏高三个数量级。为了研究CBE过度表达是否与体外高非靶点编辑发生率相关，将低剂量的SaKKH-CBE3 mRNA和sgRNA转染到含有Pahenu2基因座外显子7的HEK293T和Hepa细胞中。与质粒转染相比，CBE表达减少了18倍，在靶点编辑时保留了63%，但显著减少了RNA脱靶突变。

接下来评估了AAV介导的将SaKKH–CBE3导入Pahenu2小鼠是否会导致基因组DNA的脱靶编辑。在先前的研究中没有发现在预测的非靶基因座上有sgRNA依赖性突变，但在成人组织的碱基编辑过程中是否发生随机的非sgRNA依赖性非靶基因突变仍不清楚。每个细胞的这些突变是不同的，不能用细胞中大量DNA的全基因组测序来检测。从经治疗和未经治疗的对照小鼠中分离肝细胞，并在测序前将其克隆扩增为化学诱导的肝祖细胞（CLiP）。能够获得WGS的克隆DNA，从未经处理的对照动物中选择了3个克隆，从AAV处理的动物中选择了11个克隆，并在30×覆盖率的WGS目标位点进行了确认编辑。AAV介导的SaKKH–CBE3表达进入肝脏后，不会导致肝细胞对RNA和基因组DNA的大量脱靶脱氨作用。

对编辑小鼠的Pahenu2基因的进一步分析显示，由于对侧DNA链同时进行刻痕和碱基切除修复，SaKKH–CBE3表达导致靶基因频繁形成indel。为了减少indel的形成，用核酸酶死亡的SaKKH–CBE2和Gam–SaKKH–CBE4交换了SaKKH–CBE3，这是第四代BE，其中噬菌体Mu衍生的Gam蛋白与双链DNA断裂的结合被认为可以减少indel的形成、。然而，尽管SaKKH–CBE2和Gam–SaKKH–CBE4导致较少的indels。

接下来分析了LNP介导的肝脏碱基编辑是否会导致RNA或DNA的脱靶脱氨。考虑到这种方法只导致SaKKH–CBE3的瞬时表达，注射3毫克/千克的剂量后48小时进行了RNA序列分析。重要的是，发现CBE表达水平在内源性mAPOBEC1的范围内，与未经治疗的对照组相比，不会导致C-U转换增加。此外，胞嘧啶编辑并不优先发生在典型的APOBEC共识序列中。LNP给药一个月后，SaKKH–CBE3表达完全消失，毫不奇怪的是，再次没有观察到C-to-U脱靶突变。为了进一步评估LNP介导的SaKKH–CBE3传递是否导致基因组DNA的脱靶去氨作用，首先使用高通量测序（HTS）（>10000×覆盖率）分析了计算预测的脱靶loci。观察到这些位点没有高于背景水平的C-to-T转化。接下来重点研究sgRNA非依赖性脱靶突变，并在治疗一个月后分离肝细胞进行克隆扩增。利用LNP介导的SaKKH-CBE3 mRNA和化学修饰的sgRNA的碱基编辑能够校正疾病表型，而不会在转录组和基因组上检测到脱靶去氨作用。

本文开发了一种非病毒和短暂的碱基编辑方法来治疗单基因肝病，没有明显的脱靶效应。具有极高的临床前景。

Villiger, L., Rothgangl, T., Witzigmann, D. et al. In vivo cytidine base editing of hepatocytes without detectable off-target mutations in RNA and DNA. Nat Biomed Eng 5, 179–189 (2021). https://doi.org/10.1038/s41551-020-00671-z