环状RNA的过去，现在与未来

“所有的真理都经历三个阶段。第一，被嘲笑。第二，被激烈反对。第三，被认可且是不言而喻的。”——Arthur Schopenhauer环状RNA是近年来的研究热点。近日，美国Brandeis大学生物系的Sebastian Kadener等人在EMBO上综述了环状RNA的研究进展。BioArt对其进行了编译，以飨读者。

环状RNA（circular RNA， circRNA）是由反向剪接（back-splicing）过程产生的共价闭合环状RNA。其具有真核中丰富，进化上保守，组织特异性表达，高度稳定，可在神经组织中随衰老而累积等特点。并且，circRNA可以通过竞争剪接方式与其对应的线性RNA产物进行顺式调节。最近的报道表明它还具有反式调节功能：某些circRNAs能与microRNAs相互作用，一些可被翻译，调节免疫反应和行为。本文综述了动物circRNAs目前已知的知识，总结了circRNAs潜在功能的最新见解，起源的概念，以及本领域可能的未来方向。

发现：1976年，Sanger首次在类病毒中发现了单链共价闭合环状的RNA分子。第二份研究是1979年Hsu描述了没有自由末端的环状RNA的存在。

来源：零星的研究证实circRNAs来源于内源RNA。首篇此类报道是在1991年，偶然发现结肠癌基因缺失（DCC）发生了非经典剪接方式 (“scrambled exons”) 转录现象。随后，又发现了人类EST-1和Sry基因也有类似现象，证明这些具有scrambled exons的无polyA RNA都是circRNA。并且发现circSry具有组织特异性，且存在于3个不同的小鼠物种。

产生：在接下来的几年里，少量研究提出了这些分子产生的可能机制。这包括了假设：反向重复对Sry的环化是必须的；以及发现circRNA可以在体外通过核提取物产生。

分类：随后的90年代末期到20世纪初，研究发现多种基因可以产生circRNAs，并且对推定的circRNAs进行了简单分类为scrambled-exon，外显子重排产物（exon-shuffling products），或者只是“非线性mRNA”。此时期的研究虽然证明了这些环状RNA分子的存在，但是对其潜在的影响并未充分认识。

爆发式研究：大概在2010年开始，RNA-seq技术的发展以及专门的计算管道开发，引爆了circRNA 研究。在2010年早期，发现多细胞动物中具有成千上万种circRNA，其中多数是低表达的，但是有些是高丰度的。而且，在许多情况下，如circSry可以是该宿主基因（host gene）的主要产物。2013年的两篇文章除了证明多种哺乳动物中存在成千上万circRNA以外（野百合也有春天，小杂志开启大热门领域），还证实CDR1as (ciRS-7) 和circSry，能够结合并调节特定microRNA的活性！另外，许多工作都表明在人类，鼠，苍蝇中circRNAs是组织和发育时空特异性表达的。这些研究还描述了鉴定与定性circRNAs的新颖方法。比如，分析RNase R预处理后的无polyA circRNAs富集文库。这个方法能够富集circRNAs，也能区分真正的circRNAs和含scrambled exons的mRNAs。由于circRNAs junction的独特特性，对其鉴定和定量需要特殊设计的生物信息学计算管道。现而今，已经存在大量的管道可以注释和量化circRNAs。值得注意的是新circRNAs检测方法和管道也能检测潜在的circRNAs内部可变剪接的存在。

组织特异性与发育阶段特异性：近年来，circRNAs的组织特异性和受发育阶段调节而产生的特性被证实。四份独立工作表明多种circRNAs在大脑中高丰度存在，并且随着神经分化和发育逐渐增加。而且，circRNAs产生被神经元活动调节，而且在突触体、树突、突触神经纤维中大量存在。circRNAs普遍存在于神经组织的现象在衰老动物中更明显，积累了大量的circRNAs，暗示了circRNAs水平与细胞分裂率呈负相关性。

功能与调节：理论上，circRNAs可以顺式和反式发挥功能。2014年，Ashwal-Fluss发现circRNAs是与常规剪接共转录并且相互竞争的。因此，circRNAs的生物发生导致了同一宿主基因mRNAs合成的减少。几个课题组鉴定了外显子剪接和环化所需要之物，证实了环化信号定位在可环化外显子侧翼的内含子之内。Ashwal-Fluss也暗示了调节苍蝇中circMbl产物的负反馈调节环路的存在，在果蝇中鉴定了第一个参与外显子环化的蛋白（剪接因子muscleblind， MBL）以及其脊椎动物同源物muscleblind-like蛋白1（MBNL1）。随后的工作鉴定了其他的RNA结合蛋白RBPs能够在不同系统和生物中调控外显子环化，包括RNA腺苷脱氨酶（ADAR），quaking（QKI），FUS，核因子NF90/NF110，DHX9，表皮剪接调节蛋白ESRP1，丝氨酸/精氨酸富含蛋白。最后，目前的工作已经解释了circRNAs与不同系统间的相关性。在果蝇大脑，小鼠和人类细胞中存在能够产生蛋白质的一组circRNAs；有的circRNAs与免疫响应相关；几份报告证实了circRNAs在小鼠和果蝇大脑以及骨髓中具有功能；大量研究展示了circRNAs和癌症有关。这些发展说明了科学界对circRNAs的看法发生了清晰的改变，呈现出这个振奋人心和快速发展的领域进入了时代转折点。

外显子来源的circRNAs是通过反向剪接的特定类型剪接方式产生的，即一个5’剪接供体攻击上游3’剪接位点，形成3’-5’磷酸二酯键产生一个环状的RNA分子。尽管绝大多数真核细胞中circRNAs都是由剪接体产生，不同生物中的具体机制是不同。与动物不同，植物中的circRNAs从具有非常短的互补序列甚至完全没有互补性的长内含子的侧翼区域而来。有趣的是，古生菌中circRNAs的产生独立于剪接体，导致了各种各样的circRNAs，其中仅仅16%来源于编码基因以及更少来自于外显子。

多细胞生物中，先前报道表明剪接位点侧翼于可环化外显子是最经典的，而且反向剪接是通过剪接体执行。有趣的是，circRNAs普遍包含完整外显子而且多来源于编码外显子，特别是定位于蛋白编码基因的5’UTR。这导致了反向剪接连接由编码序列到编码序列（CDS-CDS）和5’UTR-CDS组成，趋于包含基因的第二个外显子。这可能与它们的生物发生相关，需要相较于平均而言更长和更低效剪接的内含子；通常第一个内含子满足上述两个原则。在许多情况下，circRNAs的产生源于复杂的可变剪接决定。一些基因产生多种可变剪接异构体以及circRNAs，这暗示了反向剪接和可变剪接可能是功能相关的。

外显子来源的circRNAs的产生强烈依赖以下至少一种机制：具有长反向重复或结合RBPs的内含子。两种机制都将circRNAs侧翼的内含子们紧紧挨起来。多种生物中，可环化外显子被长内含子侧腹包围，这些内含子许多都含有大量的反向互补配对。因此，内含子中反向互补重复的存在可以被用来预测外显子是否有可能发生环化。不同物种中，反向互补元件具有不同的基序（motif）与丰度，对这些基序进行序列比对指示了可能的进化关系。此外，在内含子之间和之内的反向重复元件的分布对circRNAs的数量与类型具有重大影响。尽管侧翼内含子中长反向重复促进了外显子环化，这些内含子中存在的其他反向重复可能会抑制内含子间的相互作用（inter-intronic interactions），取而代之的是内含子内的相互作用（intra-intronic interactions）。后者趋于抑制外显子环化，可能是通过内含子间二级结构竞争。

RBPs介导了另一种机制。并非所有侧翼含有长内含子的外显子都能被环化。许多可环化外显子侧翼内含子中不含有反向重复，这强烈暗示了存在外显子环化的其他机制。MBL与几个高度保守的内含子位点结合，促进了其自身基因第二外显子的环化。mbl第二外显子侧翼的内含子包含了短反向重复，似乎能够稳定内含子间相互作用，但是在缺乏MBL结合时可能太弱而不足以促进外显子环化。这强烈地暗示了MBL促进环化是通过结合到侧翼内含子从而促进内含子-内含子间相互作用。MBL分子可能发生二聚化，把两个外显子末端带到一起，从而剪接形成circRNA。其他RBPs，如QKI，FUS，ESRP1也能调节外显子环化。最后，果蝇中laccase-2基因来源的circRNAs的生物发生受到不同RBPs的共同调节，如异质核糖核蛋白hnRNPs以及SR蛋白，暗示了给定外显子的环化效率可能是多种信号的整合结果。

这种通过内含子-内含子相互作用促进环化发生至少部分源于线性剪接的空间位阻（steric inhibition）。那么，促进或打乱RNA结构的因素，可能改变circRNAs生物合成。确实，最近工作表明通过dsRNA特异腺苷脱氨酶ADAR编辑RNA，调节了circRNAs的合成。而且，RNA解旋酶DHX9通过打乱基于ALU反向重复的二级结构限制了circRNAs产生。DHX9与干扰素诱导的ADAR异构体（p150）直接相互作用，形成的复合体打乱了RNA二级结构，包括许多能够促进外显子环化的结构。下调DHX9加倍了circRNAs。这似乎是一个校正机制来减少circRNAs的广泛产生，暗示了某些circRNAs不只是“加工缺陷”或剪接噪声。

部分涉及到dsRNA结构出现的生理情形也可能改变circRNAs合成。比如，免疫响应因子NF90和NF110会调节circRNAs产生。有趣的是，这些蛋白与转录过程形成的dsRNA结构发生相互作用。NF90/NF110看起来能稳定这种瞬时双股RNA分子，促进了一组circRNAs的反向剪接。有趣的是，NF90结合位点是选择性丰富于侧翼内含子的ALU motif。因此，这些外显子的环化也可受到ADAR和/或DHX9调控。

circRNAs由RNA聚合酶II转录并且由剪接体产生。重要的是，许多形成circRNAs的外显子没有可变剪接，因此，一些高丰度的circRNAs能够顺式调节mRNA的产生。除此之外，circRNAs的产生不止与剪接有关，还与低效的裂解和polyA化相关。

如果circRNAs的产生是与经典剪接竞争，那么改变剪接效率可能会调节circRNAs的产生。通过调节顺式剪接因子或改变RNA 聚合酶II转录动力学（被认为可以调控可变剪接）可以改变剪接效率。结果确实如此，下调普遍剪接调节子如SR蛋白SF2或核心剪接体元件（小核糖核蛋白颗粒U1亚单位70K和C）snRNP-U1-70K，snRNP-U1-C，preRNA加工8（Prp8，Slu7），细胞分裂周期素40（CDC40），将产物从线性变成了circRNAs。同样，抑制转录终止增加了circRNAs合成。

circRNAs没有自由末端因此并不能通用诸多经典RNA降解途径。体外研究表明，大多数circRNAs都具有更长的半衰期（18.8-23.7h），而其线性对应物是（4.0-7.4h）。circRNAs在体内可能具有更长的半衰期，尤其是不分裂细胞，比如，大脑中随年龄增加的circRNAs积累可能是源于这些分子的稳定性与不分裂特性。与之相反，在高速增殖的细胞中circRNAs看起来不会积累，可能源于分裂快于产生导致的稀释作用。

理论上，circRNAs降解可能起始于一个核酸内切酶，随后联合外切和内切。小RNA介导的circRNAs降解是目前为止鉴定最好的circRNAs降解途径。然而，唯一的例子是CDR1as被miR-671降解。CDR1as的数量被miR-671通过AGO2介导的降解直接调节。有趣的是，CDR1as水平很可能是通过剪接被miR-7调节的，并且依赖于miR-671。

最近的一份研究暗示RNA修饰（m6A）促进了潜在可降解circRNAs的核酸内切酶的招募。另一项研究发现HeLab细胞一经poly（I：C）处理或EMCV感染即发生整体circRNAs的降解。两种处理都导致了内切核糖核酸酶Rnase L的激活以及circRNAs的降解。

除了降解，circRNAs可能被细胞外分泌。几项研究检测了外泌体中的circRNAs。然而，尚不清楚是否circRNAs的分泌对降低其胞内水平有贡献。或者，circRNAs分泌可能形成了一个交流机制。总的来说，考虑到逐渐增加的证据显示circRNAs是功能分子，它的降解、胞外运输都会是未来研究的重要问题。

circRNAs存在于绝大多数生物中。它们是如何进化的？circRNAs保守性有多个层面。

第一个是直系同源orthologous或旁系同源paralogous位点都可产生circRNAs。

某些circRNAs产生于不同物种中同样的或相同的外显子。这种情况下，保守性可能扩展到circRNAs侧翼的部分剪接位点。一份通过mapping环化剪接位点的研究分析了从人类和小鼠大脑来源的circRNAs，结果表明，大约1/3检测的circRNAs共享两个剪接位点，1/3共享一个剪接位点，表明了在哺乳动物大脑中非常高度的保守性。

最后一个水平是circRNAs内功能元件的保守性。这可能包括了RBPs结合位点，miRNA，或circRNAs内功能性二级结构所必需元件。比如，Rybak发现了短反向重复序列（某些可能是RBP结合位点）在circRNAs外显子中富集，指出了环化外显子中更高水平的保守性。

2.2组织或发育阶段以及亚细胞定位特异性表达

产生circRNAs的基因富含大脑相关基因。因此，神经组织中富含circRNAs也就不奇怪了。circRNAs丰富于CNS中是所有研究物种中的普遍特征。CNS中circRNAs的显着丰富可能源于1个或多个因素。首先，大脑，更特别的，在整个身体中神经元表现出最高水平的可变剪接。而circRNAs的生物合成可以被定义为一种特殊类型的可变剪接。第二，circRNAs半衰期长，并且神经元一般而言不会分裂，circRNAs理论上可以在大脑发育和衰老过程中不断积累甚至低效率产生。

circRNAs在小鼠苍蝇中随着衰老在大脑中大量累积，暗示了circRNAs可能参与衰老相关的大脑疾病。在细胞复制率与circRNAs数量之间存在强烈的负相关。因此，积累可能是大脑中高水平circRNAs主要的原因。

circRNAs另外一个有趣特性是其亚细胞定位。circRNAs主要定位于细胞质中。而且，报道显示神经元中circRNAs定位在轴突，树突和突触体。有趣的是，一些circRNAs表现出发育阶段特异的核-质转换定位。最近的研究鉴定了果蝇Hel25E和人类UAP49/56作为circRNAs细胞核输出的关键因子，并且以依赖circRNAs长度的方式作用。在绝大多数情况下，circRNAs共有的唯一的特征就是环状特性，外显子连接复合物的存在，以及不存在帽子结构和polyA尾巴。因此，识别和外输的机制必须不仅高度特异于特殊circRNAs也必须识别一个或多个这些特征。

circRNAs定位到轴突，树突以及突触也是很有意思的。尚不清楚这种定位是由于定向运输还是弥散后滞留。进一步的遗传和生化实验需要阐明驱动circRNAs在神经元中亚细胞定位的机制。

目前为止，尚没有研究利用活细胞图像调查circRNAs产物和运输，而此类方法将会是检验这些假说的关键。而且，这个领域仍然缺乏对不同胞内区室中circRNAs分子数目和类型的精确描述。

2.3 circRNA作为miRNA功能的调节子

一些长非编码RNA可以通过选择性吸附（sponging）调节miRNA水平和/或活性。研究表明某些circRNAs含有许多miRNA结合位点，推测这些circRNAs也可以作为miRNA海绵。比如，CDR1as具有73个seed-binding 位点对miR-7，并且，AGO2 CLIP数据表明确实有许多miR-7结合到了这些位点上。CDR1as敲除小鼠中miR-7水平温和但显着地下降，而miR-671增加，暗示了这个circRNAs的存在稳定了miR-7，而使miR-671不稳定。因此，CDR1as可能在某些信号下调节了miR-7的存储和释放。CDR1as也能够运输和释放miR-7到特殊胞内隔室，调节miR-7功能。这个功能可能在未来被利用来运输基于miRNA的治疗。

虽然对circRNAs序列完全的检测以及AGO2 PAR-CLIP数据的分析揭示了绝大多数circRNAs不能广泛结合到miRNA，仍然有其他例子如circSry，circHIPK，circFOXO3，circITCH，circBIRC6，它们都能与miRNA结合发挥功能性作用。利用AGO-RIP和CLIP技术对检测是否存在circRNAs与miRNA间直接相互作用十分关键。构建敲除和敲低细胞系研究circRNAs与推定的miRNA功能和水平间相互作用也很重要。

2017年，几个课题组报道了circRNAs可被翻译。有趣的是，可翻译circRNAs趋向于使用与宿主基因同样的起始密码子，而终止密码子则是进化保守的且特异于环状ORF。该研究还发现circRNAs是被膜偶联的核糖体翻译。另外的研究发现起始密码子上游的RRACH基序(R=G or A； H=A， C or U) 中的A被甲基化时，可以提高circRNAs的翻译。由于circRNAs不含5’帽子，它的翻译是帽子独立的。确实，某些翻译circRNAs具有内部核糖体进入位点（IRES），能够在体内和体外以帽子独立的方式翻译。有趣的是，绝大多数circRNAs预测的多肽是与其宿主基因编码蛋白质的N末端区域完全一致。这种缩短了的蛋白质可能会竞争性抑制其mRNA全长对应物。转录因子Mef2可能就是一个例子。考虑到这个领域的快速发展，我们预计在接下来几年就能看到circRNAs翻译以及产生多肽的生理效应的研究出现。

由于circRNAs能够长时间存在以及结合RBPs，它们能够作为这些因子的陷阱或者转运子。

在某些情况下，circRNAs和宿主基因蛋白可直接或间接地进行交互作用。circMbl看起来就是如此，它可能就隔绝/转运了MBL蛋白。这是假定的circMbl负反馈调节环路的一个组分。

2016年，一项研究首次表明circANRILl可以作为一个蛋白脚手架。在NIH3T3小鼠成纤维细胞，circFOXO3被发现能分别与p21和CDK2相互作用。circFOXO3-p21-CDK2三元复合物的形成阻碍了CDK2的功能，随后抑制了细胞周期进程。

研究发现，敲除CDR1as产生了神经紊乱相关的行为学表型。cia-cGAS (Cyclic GMP-AMP synthase) 通常高表达于长期培养HSC细胞核中，能够结合cGAS，阻碍了它的激活。Cas9敲除cia-cGAS下游的侧翼内含子中反向互补序列抑制其表达后，cia-cGAS缺陷小鼠中长程HSC细胞群体减少，并且升高了骨髓中type I干扰素的产量，最终导致干细胞耗竭。

最新研究表明，使用遗传编码的shRNA针对反向剪接连接敲低circMbl。当全身敲低circMbl时，导致基因表达改变，雄性发育致死，行为缺陷，翅膀姿势及飞行的缺陷。当敲低CNS中的circMbl时，导致了不正常的突触功能。

circRNAs可能还有什么样的分子功能呢？circRNA具有一个令人着迷的特征即极其稳定并且随时间积累。因此，circRNAs可以作为细胞转录历史的分子记忆分子或者“飞行记录器”。从生理学观点来看，长时间存在的circRNA可能作为具有蛋白编码潜能的存储库。一经发育改变或胁迫，这些存储器可能被翻译为调节胁迫响应或生理改变的蛋白质。突触中circRNA的本底翻译可能是非常重要的。因为circRNAs结合与RBPs，如miRNAs一样，circRNAs可能通过结合，呈递和释放它们的货物到特殊胞内区室而发挥作用。

更进一步地考虑到circRNAs存在于囊泡，它们可以被运输到整个身体，然后被特殊组织接收，作为信号分子发挥作用。另外，一个circRNA可以承载1个或几个货物分子（miRNA，RBPs），因此可以作为药物运输释放的载体。

本文综述里过去的研究，表明circRNAs具有多种功能，可以作为蛋白脚手架，招募其他类型RNA，并且通过结合miRNAs影响转录沉默、翻译和特异mRNA的降解；神经元中circRNAs的不对称分布暗示了直接细胞间运输的可能性；circRNAs能够编码从多肽到蛋白，虽然目前并不知道绝大多数可能的蛋白的生理功能，很有可能他们会与其宿主基因线性RNA编码全长蛋白共享某些能力。由于RNA技术的稳步发展，我们预计接下来circRNAs领域将会有长足的发展。进一步的对circRNAs定位，转运，活细胞内降解，完整的circRNAs相互作用组，以及单细胞图谱的理解都将在这个领域取得进步。

原始出处：

Patop IL1, Wüst S1, Kadener S1.Past, present, and future of circRNAs.EMBO J. 2019 Aug 15;38(16):e100836. doi: 10.15252/embj.2018100836. Epub 2019 Jul 25.