Nature Biotechnology：工程改造RNA聚合酶，纯化mRNA生产，减少免疫刺激副产物

mRNA疗法是一种新兴的药物，与大分子生物制剂和小分子药物相比有一些优势。从制造业的角度来看，mRNA疗法的一个关键的优势是可以使用单一的标准化生产工艺，适用于一系列靶点。

为了确保重复或长期给药的治疗应用过程中mRNA的高纯度，需要几个高成本和耗时的纯化步骤。这些额外的操作步骤常常导致RNA降解增加、质量下降和/或产量下降，因此，我们需要一个更有效的mRNA合成过程，以减少下游纯化步骤的负担。

2022年11月10日，Moderna公司的研究人员在 Nature Biotechnology 期刊发表了 题为：An engineered T7 RNA polymerase that produces mRNA free of immunostimulatory byproducts 的研究论文。

研究团队通过理性设计开发了一种T7 RNA聚合酶的双突变体，与野生型T7 RNA聚合酶相比，突变体可以简化体外转录（IVT）的mRNA生产过程，在不降低产量的情况下，提高mRNA产物纯度，显着减少免疫刺激性副产物双链RNA（dsRNA）的产生，还具有更快的生产时间。

这一发现为简化治疗性mRNA生产过程的开发、提高成本效益、生产具有临床或商业用途的基于mRNA的产品打开了大门。

体外转录（IVT）是一种用于合成mRNA产物的酶促过程。在IVT过程中，RNA聚合酶（RNAP）负责从DNA模板转录RNA。尽管IVT在研究实验室中是一个公认的过程，但工业规模生产的优化只是最近才开始。

体外转录（IVT）最常用的聚合酶是T7 RNA聚合酶，分子量约99kDa。由于其高产率和转录本的高保真度，很适合体外RNA的生产，因此在科研和商业化开发中得到了普遍应用。

然而，T7RNA聚合酶也会产生多种副产物，包括从模板转录产生的免疫刺激性副产物双链RNA（dsRNAs），这些可能会影响药效和安全性，特别是在治疗应用中。

在体外转录（IVT）过程中双链RNA（dsRNAs）和其他副产物的产生受催化循环中T7 RNA聚合酶构象的影响。T7 RNA聚合酶介导的转录包括三个不同的阶段：起始、延伸和终止。在启示过程中，T7 RNA聚合酶的N端结构域（NTD）与启动子序列结合，形成起始复合体（IC）。这种起始复合物是不稳定的，会产生短RNA转录本（长度为2-10个核苷酸）。转录本长度大于~10个核苷酸时，NTD中的启动子结合残基重新排列，释放DNA启动子区域，形成一个稳定的、过程性的酶延伸复合体（EC）。终止则发生在对特定信号序列的响应或到达线性化DNA模板末端时，这个过程被称为“失控转录”，通常会产生全长RNA，但有时会在其3'端产生非模板的附加物。

此外，T7 RNA聚合酶还具有以RNA为模板的转录能力，从而形成双链RNA（dsRNAs）产物和回环dsRNA产物。

这种3'端的异质性和回环dsRNA形成的背后的确切机制尚不清楚。因此，设计合理的方法来防止这两种行为都具有挑战性。

双链RNA（dsRNAs）分子是先天免疫反应激活因子，能够被RIG-I、MDA5和LGP2等识别，从而触发机体的天然免疫反应。因此，这些dsRNA分子会影响mRNA产物的效力和安全性，需要额外的纯化步骤从最终的mRNA产物中去除dsRNA。

在生产过程中通常使用两种方法来减少mRNA产物中的dsRNA，一种是用色谱法纯化mRNA产物，例如反相高效液相色谱法（RP-HPLC）或基于纤维素的dsRNA分离；二是优化体外转录（IVT）条件以减少副产物的形成。

修改体外转录（IVT）条件可以有效地减少dsRNA负担，但还不足以消除通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对mRNA产物进行下游纯化的需要，而RP-HPLC一个昂贵且耗时的步骤。

在这项研究中，研究团队报道了一种双突变T7 RNA聚合酶（G47A+884G），它可以显着减少体外转录（IVT）中的dsRNA副产物，同时保持mRNA的产量和纯度，从而减少下游纯化过程中控制转录相关dsRNA副产物的负担。

总的来说，这项研究表明，通过修饰T7 RNA聚合酶可以减少免疫刺激性副产物的形成。这一发现为简化治疗性mRNA生产过程的开发、提高成本效益、生产具有临床或商业用途的基于mRNA的产品打开了大门。

该论文的通讯作者为Moderna公司的Amy Rabideau，第一作者为Athanasios Dousis（目前已加入Tessera）、Kanchana Ravichandran。

原始出处：

Dousis， A.， Ravichandran， K.， Hobert， E.M. et al. An engineered T7 RNA polymerase that produces mRNA free of immunostimulatory byproducts. Nat Biotechnol (2022). https：//doi.org/10.1038/s41587-022-01525-6.