重磅Science：液体活检的挑战与未来展望

1月19日，《科学》杂志发表了一篇来自麻省理工学院和Broad研究所科学团队的最新成果，研究团队另辟蹊径从降低ctDNA的清除环节入手，开发了一种类似造影剂的预处理剂，减少cfDNA被巨噬细胞吞噬和核酸酶降解，从而大大提高了其在血液样本中的含量。在同一期杂志中，有研究团队发表了一篇对此事的评论性文章，题为“Surpassing sensitivity limits in liquid biopsy”，文章中作者分享了液体活检的背景、挑战、局限性及可能解决方案，详细介绍了对麻省理工最新成果的看法，最后对液体活检的未来进行了展望。

图片来源：Science

背景

cfDNA可以在血液中发现，当从癌症患者身上提取时，它含有肿瘤来源的片段(ctDNA)。在晚期肿瘤中，检测耐药机制或可操作靶点的ctDNA分析已经转化为临床实践。近年来，ctDNA方法不断扩展到早期疾病阶段。然而，癌症筛查和微小残留疾病(MRD)分子检测的持续挑战是需要提高灵敏度，以便以高准确性检测微量的ctDNA。大多数提高灵敏度的尝试都集中在离体策略上，如取样、分析部分(如文库制备)和生物信息学。而Martin-Alonso等人报道了通过瞬时调节体内cfDNA的自然清除机制来增加其在血液样本中的浓度来应对这一挑战。

降低体内cfDNA清除率可提高液体活检的敏感性。图片来源：Science

挑战

血液中cfDNA(和ctDNA)的数量由其释放和其降解和清除(通过核酸酶消化、肾脏排泄和肝脏单核吞噬细胞系统(MPS)巨噬细胞摄取介导)的相互作用决定。考虑到cfDNA的快速清除，估计半衰期为30至120分钟，从10毫升血液中，可以分离出约5毫升血浆，平均每毫升提供10纳克cfDNA，相当于大约15,000个单倍体基因组当量(GEs)。平均而言，在晚期癌症患者中，ctDNA可能占总cfDNA库的10%或更高。然而，在局部进展疾病中，ctDNA含量大幅下降至0.1 - 1%，在早期疾病或经过治疗后，ctDNA含量下降至<0.1%。当ctDNA分数低至0.1或0.01%时，这意味着只有15或1.5个GEs分别来源于肿瘤。这样的血液样本可能不含有足够的ctDNA片段来进行有效的测序或检测。

常规解决方案与局限性

通过血浆置换提高样本体积是提高GE和克服抽样偏差的一种选择。然而，这需要昂贵的仪器，耗时，并且可能不适用于危重患者。为了更有效地捕获ctDNA，近端采样的概念已经被引入。近端采样指的是在离肿瘤更近的地方采集样本和体液。膀胱癌患者尿液cfDNA分析已被报道。最近，体内干预如聚焦超声或辐射，被提出可暂时增加ctDNA脱落。然而，近端取样和增强ctDNA释放都需要对肿瘤位置的先验知识，这使得该方法无法用于早期检测癌症的筛查方法。

增加ctDNA脱落的方案。图片来源：Science

降低体内cfDNA清除率是另一种可行的策略

这篇发表在Science上的文章中，来自麻省理工学院和Broad研究所科学团队Martin-Alonso等人提出了一项新的概念验证研究，使用临床前模型，包括健康小鼠和携带结肠直肠癌细胞的小鼠，通过静脉注射启动剂（priming agents）在体内短暂延迟cfDNA清除，最大限度地提高ctDNA的回收率(见下图)。天然cfDNA主要与组蛋白结合并作为单核小体存在于循环中。在荷瘤小鼠中，他们证明了类似大小的脂质体纳米颗粒可以通过与MPS摄取竞争来减弱吞噬清除。为了进一步提高cfDNA和ctDNA的丰度，作者使用了去除FcyR结合的单克隆抗体来保护cfDNA免受循环DNase的酶切。在抽血前1 - 2小时给药，两种药物使cfDNA和ctDNA分子的回收率增加了10倍以上。应用脂质体将ctDNA检测的灵敏度提高了60倍，特别是在肿瘤负荷低的小鼠中。但在配方测试和耐受性方面，这种策略如何转化给人类使用仍有待确定。

降低体内cfDNA清除率。图片来源：Science

提高诊断灵敏度的方法

可用GEs的数量决定了分析灵敏度。增加信噪比以可靠地区分真正的肿瘤相关突变是必要的。在减少测序错误影响和提高突变检测信心方面的重大突破是使用分子条形码与复杂的生物信息学分析相结合，从而实现错误抑制。例如，两条DNA链被独立标记和测序，与标准测序相比，误差减少了1000倍，但代价相当大。为了减少每个靶标所需的测序reads，MAESTRO技术被开发出来，使用短探针来富集患者特异性突变等位基因。在文库制备过程中对特定cfDNA片段亚群的富集和生信选择性恢复特定片段大小也可能提高ctDNA检测。

另一个克服GEs有限可用性的策略是扩大MRD突变跟踪的范围，筛选更广泛的突变序列，这可能大大增加检测到ctDNA的几率，检出下限与标记物的数量呈负相关。

MAESTRO方法提高了检测灵敏度。图片来源：Nature Biomedical Engineering

挑战和展望

为了广泛使用ctDNA来检测早期癌症，需要更普遍的ctDNA检测，提供更广泛的患者覆盖范围、更快的周转时间和潜在的成本效益。突变之外的cfDNA特征，如片段特征、核小体特征和甲基化模式，可能提高灵敏度界限。无论哪种策略(或其组合)将占主导地位，提高ctDNA分析的灵敏度仍然是提高液体活检在癌症诊断和监测中的临床应用的关键。展望未来，整合多种分析数据——包括RNA；外泌体；循环肿瘤细胞、蛋白质和代谢物，并结合不同的分子特征，例如基因组学和表观遗传学有望进一步提高液体活检的敏感性和特异性。

除了提高灵敏度的要求外，其他挑战仍然存在，包括液体活检方案标准化的需要，解决实验室间的差异，以及伦理和监管方面的考虑(例如：处理假阴性和假阳性结果和成本覆盖)。此外。高灵敏度技术的成本效益评估值得关注，以便在临床环境中广泛使用。学术界、工业界和监管机构之间正在进行的研究和合作对于改进现有方法、克服这些挑战以及释放液体活检彻底改变癌症诊断和治疗的全部潜力至关重要。重新定义液体活检的旅程仍在继续，随着每一次突破，早期癌症检测成为现实的未来越来越近。

降低体内cfDNA清除率的临床应用。图片来源：Science