Nat Commun：最小基因剪刀问世！
2017-02-23 MEI 生物360
基础科学研究所（IBS）与 KIM Eunji（ToolGen Inc.）和 KIM Jeong Hun（首尔国立大学）合作，设计了迄今为止最小的 CRISPR-Cas9，通过腺相关病毒（AAV）将其递送至肌细胞和小鼠的眼睛，并用它来修改致盲基因。这种 CRISPR-Cas9 系统源自空肠弯曲杆菌（CjCas9），预计将成为一种有效的“不可排除”疾病的治疗工具。该研究发表在 2 月 21 日的《N
基础科学研究所（IBS）与 KIM Eunji（ToolGen Inc.）和 KIM Jeong Hun（首尔国立大学）合作，设计了迄今为止最小的 CRISPR-Cas9，通过腺相关病毒（AAV）将其递送至肌细胞和小鼠的眼睛，并用它来修改致盲基因。这种 CRISPR-Cas9 系统源自空肠弯曲杆菌（CjCas9），预计将成为一种有效的“不可排除”疾病的治疗工具。该研究发表在 2 月 21 日的《Nature Communications》上。
CRISPR-Cas9 是分子生物学家的流行词。 它能够高效、简便和精确的编辑基因。 Cas9 是“基因剪刀”蛋白质：它在向导 RNA 所指示的精确位置上进行靶基因切割。 为了使 CRISPR-Cas9 复合物到达靶 DNA，其必须通过质粒或病毒递送。 IBS 中心基因组工程中心主任 KIM Jin Soo 解释说：AAV 是一种在体内表达目的基因的有效和安全的载体，并已广泛用于基因治疗。 自然地，Cas9 被几种细菌用作免疫武器； 需要切割可能损害细菌的病毒 DNA。 最常见的 CRISPR-Cas9 技术使用化脓性链球菌的 Cas9（SpCas9）。 然而，该蛋白质由 1，368 个氨基酸制成，因为其太大而不能在 AAV 中递送和包装。 即使科学家将它分成两部分，每个包装在不同的病毒，但会出现其他问题：需要双重量的病毒来递送，并且分裂 Cas9 比完整的 SpCas9 活性低。 金黄色葡萄球菌 Cas9 也用于基因编辑。虽然它相对较小（1，053 个氨基酸），适合在 AAV 内，但不能留下足够的空间用于其他蛋白质。
在这项研究中，团队发现 CjCas9 既高效又足够小。 它有 984 个氨基酸，它可以与多个指导 RNA 以及荧光报告蛋白一起包装在 AAV 中。
为了使用细菌蛋白质进行基因编辑，科学家不得不优化该技术的某些方面。 他们设计了一个短的 DNA 序列，紧接着由 Cas9 靶向该 DNA 序列，称为前间区序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）。 每个不同的 Cas9 需要特定的 PAM 序列，否则将不能结合和切割靶 DNA 序列。其次，他们不得不修改向导 RNA 的长度。
随后，IBS 科学家将新的 CRISPR-Cas9 复合体与两个向导 RNA 和荧光报告蛋白一起包装到 AAV 中，以在小鼠肌肉和眼睛中修改基因。他们集中在涉及年龄相关性黄斑变性（AMD）的两个基因，因为这两个基因是成年人失明的主要原因之一。 一个基因是 ADM 的常见治疗靶标，称为血管内皮生长因子 A（VEGF A），另一个基因是激活 VEGF A 转录的转录因子，被称为 HIF-1a。 与 VEGF A 不同，HIF-1a 未被认为是药物靶标。 所谓的“可流产”基因，例如一般的转录因子，不能被抗体和其他生物或化学药物直接靶向。 在这项研究中，研究小组证明 CjCas9 通过 AAV 传递到视网膜可以有效地灭活小鼠中的 Hif1a 和 VEGF A，并减少脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
眼内注射 AAV 包装的 CRISPR-CjCas9 可以有益于治疗各种视网膜疾病和全身性疾病。 KIM Jin-Soo 解释说：CjCas9 是高度特异性的，不会导致基因组中的脱靶突变。
小鼠和人的 Hif1a 基因靶序列是相同的，因此本研究中提出的方法将来可用于治疗人类患者的 ADM。 通过铺平 CjCas9 应用于“不可排除”基因或非编码序列的方式，这种技术可以拓宽治疗靶标的范围，使得整个人类基因组潜在地可药物化。
参考文献：
Eunji Kim,Taeyoung Koo,Sung Wook Park,et al.In vivo genome editing with a small Cas9 orthologue derived from Campylobacter jejuni.Nature Communications,17 October 2016.
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