【衡道丨干货】肺结节冷冻切片如何制作效果最好？

判断肺结节性质可指导肺癌手术策略，而肺组织冰冻切片的质量一般不如常规石蜡切片，加上取材误差和制片时间限制，肺组织的冰冻准确率大多低于90%，尤其在原位腺癌和微浸润性腺癌的诊断中。不同切面测量肿瘤浸润范围、组织学形态易受到冷冻切片细胞染色对比度不良、冰晶、制片重叠及炎症、纤维化或瘢痕、肺泡空间塌陷等多因素均影响肺结节性质判断。

以下就由深圳市人民医院的姜阳阳老师分享一些肺结节冷冻切片的小技巧，供大家参考。

 1、冷冻时间和切片温度

不同的组织由于含水和含脂比例不同，冷冻时间和切片温度略有差异。肺是血气交换的场所，肺癌标本中常常混有血液，水分含量高，血液含量决定着肺癌组织的冷冻时间和最佳切片温度。日常工作中，可以通过组织颜色来判断血液含量，肺组织呈粉红色，说明血液较少，肺泡腔内气体较多，肺组织呈暗红色说明血液较多。粉红色的肺冻得稍慢，暗红色的肺冷冻速度较快。而暗红色的肺组织建议开启急速降温，加速冷冻，快速冷冻可以减少冰晶的产生。由于切片机内冷冻区域的温度大大低于机箱显示温度，如遇到多份冷冻标本扎堆送检的情况，建议根据个人切片速度适当冷冻标本数量，长时间低温会导致细胞核皱缩，肺癌标本的冷冻时间不宜超过5min（从OCT完全凝固开始）。

通常肺组织的最佳切片温度约-20℃（这里说的不是冷冻切片机箱体的温度，而是样品头的温度），在此温度区间，均可以制作较满意的切片。有两种特殊情况除外，干酪样坏死和错构瘤因成分特殊，切片温度建议升高至-15℃。

含血少

含血多

结核

软骨瘤样错构瘤

2、切片厚度

通常冷冻切片的厚度约为6~8μm，除了脂肪组织和富于淋巴细胞的组织，一般较少切换切片厚度，在肺癌组织冷冻制片时，有时需要切得稍厚一些，建议切9~10μm，尤其是对于肺泡间隔没有明显增宽的早期肺癌，切片太薄会导致肺泡壁断裂，切片裂隙多，肿瘤间质缺乏连续性，最终难以评估肿瘤性质。我院的实际经验：经修片完全暴露肿瘤组织，常规做一薄一厚两张切片，能提高病理医生对肺结节性质判断的准确性。

7微米

9微米

3、提高切片完整性

早期肺癌以楔形切除和肺段切除为主，该方法切除组织较少，病人恢复快，目前送检早期肺癌的肿瘤直径常常小于1cm，肿瘤大部分用于冷冻切片评估，冷冻剩余组织经后续石蜡切片可能会进一步变小，因此冷冻制片的评估十分重要。而肺内肿瘤组织的占据或者局部的炎症刺激，导致病变周围肺泡腔代偿性扩张，肺泡壁更加纤细，切片时极容易断裂而导致切片不完整，增加了漏诊和误诊的概率。经长期摸索，OCT手动填充法可完美解决此问题，具体步骤如下：

注：当切片出现很多空洞时，在载玻片上滴一滴OCT，轻轻平压在组织上，迅速移开载玻片，待组织上OCT重新凝固，稍精修暴露组织，再切片

胸膜完整性是肺癌冷冻制片的重要考虑因素，大多数腺癌是紧邻胸膜生长，肿瘤细胞是否突破脏层胸膜弹力纤维层，作为肺癌是否侵犯胸膜的病理评判标准。据报道，弹力纤维染色可以清楚显示冷冻片中的胸膜内弹力纤维，弹力纤维呈波浪状，或宽或窄。技师在包埋前需观察冷冻组织是否带有胸膜，肉眼辨别胸膜比较简单，组织光滑整齐面一般就是脏层胸膜面，在包埋时需要立埋，切片时需垂直于刀片。

4、固定液的选择

固定的主要目的是保持组织细胞形态特征清晰和稳定，固定的好坏直接影响染色质量，冷冻制片的及时固定，充分固定由病理技师亲自掌握，因此做到及时充分固定并不难，固定液的种类也有多种，本人亲测了几种常用固定液，发现均可以用于肺癌组织冷冻固定，染色效果良好。常用的单纯固定液，如甲醇，95%乙醇；混合固定液如AF液，AAF液（由甲醛、乙醇和冰醋酸组成），乙醚酒精混合液，冰醋酸甲醇固定液等，混合固定液的固定速度更快，缺点是需要单独配制，不宜存放过久。

5、水洗和掉片

肺癌标本中通常混有血液成分，红细胞在组织冷冻时破碎，血红蛋白释放进入肺泡腔，而肺泡腔渗出液中存在许多组织细胞和泡沫细胞，经血红蛋白覆盖后，这些细胞很难与脱落的肿瘤细胞区分。根据我个人经验，充分水洗可以去除血红蛋白，至少需要流水冲洗30秒。

肺叶完整切除的标本，支气管切缘情况是病理评估的重要内容，支气管包含软骨成分，容易掉片，冷风干燥可以有效地减少富含纤维、软骨或坏死的组织冷冻切片的脱片现象，为了防止脱片，常规冷风干燥支气管切缘的冷冻制片，吹风机冷风干燥切片仅需几秒即可完成。

参考文献: 

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[2]林兴滔,葛岩,王慧玲,豆文宪,朱小兰.冷冻切片干燥处理对HE染色效果的影响[J].临床与实验病理学杂志,2017,33(04):463-464.DOI:10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.030.