Hepatology: Kupffer细胞中的YAP促进非酒精性脂肪性肝炎的进展

到目前为止，尽管非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）从非酒精性脂肪肝发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的确切机制仍有待进一步明确，但多种因素，包括脂肪毒性，内质网应激，氧化应激，肠道微生物群，以及表观遗传因素与NAFLD的发病机制有关。

Hippo通路及其效应蛋白，叶相关蛋白(YAP)与肝脏再生和癌变有关。机制上，活化的YAP进入细胞核，与转录因子TEA域 (TEAD)结合，促进靶基因的转录，调控细胞的存活、增殖和干性。虽然YAP的增殖和致癌作用已被证实，但它是否参与非肿瘤性肝病的发病机制尚不清楚。

2020年7月，来自美国新奥尔良杜兰大学医学院的Tong Wu教授课题组在Hepatology（IF： 14.679）杂志上发表题为“Yes-Associated Protein in Kupffer Cells Enhances the Production of Proinflammatory Cytokines and Promotes the Development of Nonalcoholic Steatohepatitis”的文章[1]。本研究中，作者报道Kupffer细胞(KCs)中的YAP可促进促炎细胞因子的产生并促进非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发展。数据显示，喂养高脂饲料(HFD)的野生型小鼠KCs中YAP的表达显着增加。本研究描述了YAP在KCs中调节NASH肝脏炎症的重要作用。该研究提示抑制YAP可能是NASH治疗的有效策略。

主要结果

研究人员首先检测了NCD-(5%脂肪)和HFD喂养(60%脂肪)小鼠肝脏中YAP的表达。发现与NCD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠肝脏中YAP表达增加。IHC和IF分析显示，HFD诱导的YAP主要定位于KCs，而HFD喂养小鼠的肝细胞只显示出微量的YAP染色。在IF条件下，用F4/80(巨噬细胞/KCs的标记物)对饲喂小鼠肝脏中的YAP进行共定位，发现NCD喂养的小鼠肝脏中YAP和F4/80水平较低。为了进一步表征YAP的表达和细胞内定位，利用流式细胞仪分析了YAP的表达。与NCD喂养的小鼠相比，HFD喂养小鼠F4/80阳性KCs的细胞核中YAP荧光强度增加。然后，研究人员从HFD和NCD喂养的小鼠中分离出原代KCs和肝细胞，通过qRTPCR检测YAP mRNA水平。YAP mRNA的表达在HFD喂养小鼠的基础KCs中显着上调。

在NAFLD环境中，KCs中Yap的减少可减轻炎症，但不能减轻脂肪变性。为了评估YAP在KCs中的作用，研究人员利用巨噬细胞/单核细胞特异性YAP敲除小鼠(YAP？KO)。与WT小鼠相比，HFD喂养的YAP？KO小鼠表现出AST和ALT水平下降。与WT小鼠相比，YAP？KO小鼠出现小叶炎症，尽管脂肪变性程度两组之间相当。接下来，分析了HFD喂养的YAP？KO小鼠肝脏中的促炎细胞因子的表达。发现，YAP？KO小鼠肝组织和分离的KCs中几种促炎细胞因子的表达降低，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1。此外，相比WT小鼠，YAP？KO小鼠肝脏中的F4/80阳性KCs数目明显减少。这些发现提示YAP在KCs中调节NAFLD中细胞因子的产生和肝脏炎症的重要作用。与HFD喂养的WT小鼠相比，来自HFD喂养的YAP？KO小鼠的KC M1标记分子（CD80和CD86）明显减少，而M2标记分子（Mgl2和Retlna）明显增多。

研究人员试图进一步确定LPS/TLR4信号是否会影响KCs中YAP的激活。通过用LPS孵育初级KCs，观察到LPS处理增加了YAP蛋白和mRNA， IF和qRT-PCR分析证实了这一点。流式细胞术分析显示LPS处理增加了F4/80阳性KCs的YAP蛋白。qRT-PCR分析显示LPS处理增加了KCs中YAP和TNF-α的表达。为进一步探讨TLR4在KCs中调控YAP的作用，研究人员利用巨噬细胞/单核细胞-特异性TLR4敲除（TLR4？KO）小鼠。与来自对照小鼠的KCs相比，来自TLR4？KO小鼠的KCs中LPS诱导的YAP表达明显减少。正如所料，来自TLR4？KO小鼠的KCs中TNF-α的mRNA水平也较低。这些发现揭示了LPS/TLR4信号通路在KCs中调控YAP的重要作用。

Yap激活增加KCs中促炎细胞因子的产生。为了描述YAP对促炎细胞因子表达的影响，我们分离了小鼠原代KCs，并将细胞转染组成活性型YAP (YAP5SA)，其中五个Ser残基被Ala取代。通过在转染细胞中检测YAP IF，验证YAP转染成功。观察到活性YAP (YAP5SA)的过表达导致KCs中促炎细胞因子的产生显着增加，包括TNF-α、白介素1-(IL-1β)、IL-6和MCP-1。接下来我们利用YAP的药物性抑制剂verteporfin来评估其对细胞因子产生的影响。发现，verteporfin处理显着抑制了脂多糖诱导的促炎细胞因子的表达，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1。另外，verteporfin处理还抑制了LPS诱导的促炎细胞因子的启动子-荧光素酶活性。进一步，研究发现LPS通过活化AP-1诱导巨噬细胞Yap基因表达。

Yap抑制剂verteporfin可减轻NAFLD的肝脏炎症。为了评估YAP抑制对NASH治疗的潜在疗效，研究人员利用Yap抑制剂verteporfin来处理HFD喂养的小鼠。观察到verteporfin处理显着降低了肝脏转氨酶(AST和ALT)的水平。也显着抑制了KCs中促炎细胞因子的产生。与未治疗组相比，用verteporfin处理的小鼠表现出较少的小叶炎症，尽管两组均表现出相似程度的肝脂肪化。另一方面，观察到与未治疗组相比，经verteporfin处理组肝脏组织中F4/80阳性KCs降低。这些发现为应用YAP抑制剂治疗NASH提供了重要的临床前证据。

在NASH患者中Yap升高并与促炎细胞因子相关。为了评估所发现的临床相关性，研究人员使用NCBI数据库中获得的GEO数据集(GSE48452和GSE61260)对NASH患者进行基因表达分析。与正常肝脏相比，NASH患者肝脏组织中YAP表达明显升高。YAP水平与促炎细胞因子(IL-1细胞因子、MCP-1、TNF)表达呈正相关。YAP水平与M1标记物(CD80和CD86)呈正相关，与M2标记物(精氨酸酶1)呈负相关。此外，观察到YAP水平与肝纤维化分期和纤维化发生基因表达呈正相关。在IF分析下，研究人员观察到NASH患者肝脏组织中YAP表达增加，且与活化的人KC标记物CD14共局域化。该结果证明了YAP信号在KCs中的促炎作用，以及它与LPS/TLR4信号的串话在NASH发病机制中的作用。

结论

本研究结果表明，YAP介导的KC激活通过促炎细胞因子的产生和肝脏炎症的持续，对NASH的进展起关键作用。此外，表明了 LPS/TLR4信号通路转录激活KCs中的YAP，这为LPS介导的NAFLD进展中的炎症提供了机制上的见解。因此，抑制YAP可能是治疗NASH的一种策略。

原始出处：

Kyoungsub Song 1， Hyunjoo Kwon 1， Chang Han 1， et al.Yes-Associated Protein in Kupffer Cells Enhances the Production of Proinflammatory Cytokines and Promotes the Development of Nonalcoholic Steatohepatitis.Hepatology. 2020 Jul；72(1)：72-87. doi： 10.1002/hep.30990. Epub 2020 Apr 11.