王洁/汤富酬/赫捷发现：肺癌患者中，广泛存在混合谱系癌细胞！

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，据统计，2020年全球约有180万人死于肺癌[1]。从组织病理学上，肺癌主要分为两大类：小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。非小细胞肺癌是肺癌的主要肿瘤类型，约占肺癌总数的84%。非小细胞肺癌又可以进一步分为三个亚型：腺癌（ADC）、鳞癌（SCC）和大细胞癌（LCC），其中大细胞癌的主要亚型大细胞神经内分泌癌（LCNEC）和小细胞肺癌都属于神经内分泌癌（NET）。已有的研究表明，腺癌、鳞癌和神经内分泌癌起源于不同类型的正常肺上皮细胞，具有不同的组织病理学特征和分子特征，对应于不同的临床治疗方案[2]。随着单细胞测序技术的突飞猛进，单细胞转录组测序技术已被广泛应用于肺癌研究中，包括研究肿瘤组织的细胞组成、解析肿瘤免疫微环境的特征等，但是对于肺癌中肿瘤细胞的异质性仍需进一步阐释，从而助力于肿瘤的个体化精准医疗。

2022年8月13日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬教授团队与中国医学科学院肿瘤医院王洁教授团队、赫捷院士团队合作在Genome Medicine上发表了题为Molecular profiling of human non-small cell lung cancer by single-cell RNA-seq的研究论文。该研究利用高精度单细胞转录组测序技术对人类原发性非小细胞肺癌的分子特征进行了系统分析，在单细胞转录组水平鉴定出一群全新的混合谱系肿瘤细胞并对其关键生物学特征展开了深入研究。

该研究有4个主要发现：

1.发现一类全新的混合谱系肿瘤细胞，并且这类混合谱系肿瘤细胞在所有非小细胞肺癌患者中普遍存在。

研究者利用高精度单细胞转录组测序技术对来自19例原发性非小细胞肺癌患者（14例腺癌、3例鳞癌、1例复合型小细胞肺癌、1例混合型腺癌和神经内分泌癌）和1例软骨瘤型错构瘤患者的癌旁组织和肿瘤组织的7,364个单细胞的转录组测序数据进行了分析。根据细胞类型特异性标志基因的表达情况，鉴定出了6种主要细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、髓系细胞和肥大细胞。通过对其中来自16例患者的3,373个癌旁上皮和肿瘤上皮细胞进行深入分析，发现77.5%的肿瘤细胞会在同一个单细胞中同时表达两种甚至三种不同肿瘤亚型特异性的标志基因（腺癌：NKX2-1、NAPSA、KRT7；鳞癌：TP63、KRT5、KRT6A；神经内分泌癌：CHGB、SYP、NCAM1)。该研究将这群细胞命名为混合谱系肿瘤细胞（图1）。更重要的是，该研究所分析的所有16例患者的肿瘤样本中均含有这类混合谱系肿瘤细胞（在不同患者的肿瘤组织中的比例为3.8%-100%），这说明这类全新发现的混合谱系肿瘤细胞在非小细胞肺癌患者中是普遍存在的，很可能是所有非小细胞肺癌患者的共性特征。

图1.肺癌不同肿瘤亚型标志基因在上皮细胞中的表达情况。

以往基于10x Genomics平台获得的单细胞转录组测序数据，由于doubles率（双细胞混杂率）和交叉污染率相对较高，常常很难鉴定出这种混合谱系肿瘤细胞。而该项研究使用的是基于STRT-seq改进的高精度单细胞转录组测序技术，由于每个单细胞是研究者使用口吸管在高倍显微镜下精准挑取的，只有完整且不粘连任何细胞碎片的单个细胞才会被挑取出来用于单细胞测序，因此获得的数据精度非常高。在相对较少的单细胞测序数量(每个患者只测序几百个单细胞)中，就可以准确地鉴定出混合谱系肿瘤细胞。进一步，该研究使用多重RNA原位杂交和多重免疫荧光染色技术分别在RNA水平和蛋白水平在肿瘤组织切片上原位验证了这类混合谱系肿瘤细胞普遍存在（图2）。

图2.腺癌标志基因NKX2-1和鳞癌标志基因TP63在肺癌组织中的多重免疫荧光染色和多重RNA原位杂交情况。

2.发现在同一个非小细胞肺癌患者体内的混合谱系肿瘤细胞和经典的单谱系肿瘤细胞来自共同的肿瘤前体细胞。

混合谱系肿瘤细胞的产生可能和肿瘤细胞的异常分化有关，揭示同一个患者体内的混合谱系肿瘤细胞和单谱系肿瘤细胞之间的起源关系，是理解混合谱系肿瘤细胞可塑性的基础。为了研究同一个患者体内的混合谱系肿瘤细胞和单谱系肿瘤细胞之间的起源关系，该研究使用了谱系追踪的分析手段。过去常用的肿瘤细胞谱系追踪手段包括遗传标记工具、单核苷酸变异（SNV），染色体拷贝数变异（CNV）和短串联重复序列（STR）变异等。近年来研究者们发现由于线粒体DNA（mtDNA）在单个细胞中拷贝数多（～100-1000个拷贝），突变率相对核DNA高很多（～10-100倍）以及突变异质性大等特点，线粒体突变可以作为体细胞谱系回溯的有效手段[3]。在该项研究中，研究者利用单细胞线粒体突变和染色体拷贝数变异（CNV）相结合的谱系追踪分析手段对单细胞转录组测序数据进行细致分析，证实在同一个非小细胞肺癌患者体内，混合谱系肿瘤细胞和单谱系肿瘤细胞来自共同的肿瘤前体细胞，而不是各自独立起源的（图3）。这表明混合谱系肿瘤细胞的可塑性非常强，可能很容易在单谱系状态和混合谱系状态之间切换表型，这给非小细胞肺癌容易复发、容易耐药的临床特性提供了可能的解释。

图3.不同类型肿瘤细胞的单细胞线粒体突变和染色体拷贝数变异情况。

由于该研究中测序细胞数和检测到的线粒体突变位点有限，目前还不能明确混合谱系肿瘤细胞和单谱系肿瘤细胞的具体进展方向，但研究者推测在一个非小细胞肺癌患者体内，最可能的是首先一种特定谱系的正常上皮细胞在早期癌变过程中转化成了单谱系肿瘤细胞，然后其中一部分肿瘤细胞进一步转化成混合谱系肿瘤细胞，获得了更强的细胞可塑性。当然这也不排除在肿瘤发展的后期，混合谱系肿瘤细胞转化回单谱系肿瘤细胞状态。这两者之间的具体转化方向未来还需要进一步探究。此研究发现的混合谱系肿瘤细胞可能为研究非小细胞肺癌患者中不同肿瘤亚型之间的转分化提供新的研究视角

3.发现混合谱系肿瘤细胞的比例和特征与非小细胞肺癌患者的不良预后密切相关。

混合谱系肿瘤细胞同时具有两种甚至三种不同肺癌肿瘤亚型的分子特征，暗示其具有很强的细胞可塑性以及更高的基因表达程序紊乱，这很可能是非小细胞肺癌临床治疗失败和肿瘤复发的原因之一。为了进一步研究混合谱系肿瘤细胞的比例和特征与患者预后的关系，研究者利用scRNA-seq数据鉴定出的腺癌、鳞癌和神经内分泌癌的标志物，对TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌的大量细胞RNA-seq数据进行精细解析。根据三组肿瘤亚型标志物的差异表达特征，将患者分成具有高混合谱系肿瘤细胞比例和特征组和低混合谱系肿瘤细胞比例和特征组。结合这些样本的临床信息，对两组间的生存预后关系进行比较分析，发现无论对于肺腺癌还是肺鳞癌，具有高混合谱系特征的患者，相比于具有低混合谱系特征的患者，其总生存期和无进展生存期都明显缩短（图4）。这些结果表明混合谱系肿瘤细胞的比例和特征与患者的不良预后密切相关，进一步提示对于具有高混合谱系特征的患者在临床管理和治疗中应引起重视。

图4.肺腺癌和肺鳞癌患者的生存曲线分析。

4.鉴定出了混合谱系肿瘤细胞特异性高表达的一组标志基因，并对其中的AKR1B1基因进行了功能验证。

该研究鉴定出了混合谱系肿瘤细胞相对于单谱系肿瘤细胞特异性高表达的73个标志基因，其中包括细胞间质相关基因FN1、TGFBI、COL1A1以及调控上皮细胞分化相关基因AKR1B1、 SPRR1B以及角蛋白基因KRT6A、KRT19、KRT17等。值得注意的是，AKR1B1在四种混合谱系肿瘤细胞中都特异高表达（图5a-b）。已有报道AKR1B1是多元醇代谢途径的限速酶，并且可以通过上皮-间质转化（EMT）途径促进乳腺癌的侵袭和转移，以及在肺癌和结直肠癌中通过EMT途径使肿瘤细胞获得干细胞的特征，从而表现出细胞可塑性[4, 5]。因此，研究者猜测AKR1B1是混合谱系肿瘤细胞具有更强可塑性的一个重要调控因子。通过在体外肿瘤细胞系和小鼠异种移植模型中对AKR1B1分别进行siRNA敲降和使用小分子靶向药物进行蛋白功能抑制的实验，结果表明AKR1B1基因促进肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的凋亡，提示AKR1B1参与调控了混合谱系肿瘤细胞的可塑性（图5c-h）。

图5.混合谱系肿瘤细胞标志基因AKR1B1的功能研究。

综上所述，该研究利用高精度单细胞转录组测序技术，深入分析了16例人类原发性非小细胞肺癌患者体内肿瘤细胞的分子特征，发现一类全新的混合谱系肿瘤细胞，这类混合谱系肿瘤细胞在非小细胞肺癌患者中广泛存在。并进一步证实在同一个非小细胞肺癌患者体内，混合谱系肿瘤细胞和单谱系肿瘤细胞来自共同的肿瘤前体细胞。这表明混合谱系肿瘤细胞的可塑性非常强，可能很容易在单谱系状态和混合谱系状态之间切换表型，这给非小细胞肺癌容易复发、容易耐药的临床特性提供了可能的解释。该研究为非小细胞肺癌肿瘤亚型更为精准的分型提供了新的线索，未来对于具有高混合谱系特征的非小细胞肺癌患者的诊断和治疗具有重要的指导意义。

北京大学生命科学学院博士后李晴晴、汪睿博士、中国医学科学院肿瘤医院杨震林博士为该论文的并列第一作者。北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬教授与中国医学科学院肿瘤医院王洁教授和赫捷院士为该论文的共同通讯作者，此项研究得到了北京市高精尖创新中心、国家自然科学基金重点、北京市自然科学基金、教育部创新团队发展计划的支持。

论文链接：

https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-022-01089-9