盘点：细数“魔剪”CRISPR所立下的功劳
2016-08-22 MedSci MedSci原创
近几年，基因编辑技术飞速发展，已成为全球科学家争相研究的热门领域之一。进入6月以来，CRISPR技术的发文热潮仍在持续，多项研究发表在Science、Nature Biotechnology等顶级期刊上。CRISPR技术大热也成就了一大波学术明星。科学家们认为这一技术未来将具有难以想象的使用价值。接下来，小编列举最近一段时间CRISPR基因编辑系统取得的重大进展，详情如下所示。【1】Scien
近几年，基因编辑技术飞速发展，已成为全球科学家争相研究的热门领域之一。进入6月以来，CRISPR技术的发文热潮仍在持续，多项研究发表在Science、Nature Biotechnology等顶级期刊上。CRISPR技术大热也成就了一大波学术明星。
科学家们认为这一技术未来将具有难以想象的使用价值。接下来，小编列举最近一段时间CRISPR基因编辑系统取得的重大进展，详情如下所示。
【1】Science：“魔剪”CRISPR鉴定出跟腹泻有关的关键蛋白
8月18日，发表在Science上的一项研究中，来自华盛顿大学和Broad研究所的科学家小组在CRISPR/Cas9技术的帮助下，鉴定出了诺如病毒入侵细胞所需的关键蛋白。
当利用CRISPR/Cas9敲除一种称为CD300lf的基因时，诺如病毒失去了感染细胞的能力。这一基因编码了小鼠细胞表面的一种蛋白。研究人员相信，病毒是通过“抓住”这一蛋白进入细胞内的。
此外，研究还发现，当人细胞表面表达鼠CD300lf蛋白时，小鼠诺如病毒能够感染人类细胞并增殖。Virgin说：“小鼠诺如病毒在人类细胞中生长的很好。这表明，诺如病毒感染的物种限制与进入细胞的能力有关。”
另一个重要的发现是，小鼠诺如病毒感染细胞需要一个辅助分子，仅靠CD300lf是不够的。不过，研究小组还没有确定这一分子的“身份”。该研究的第一作者Robert C. Orchard说：“病毒需要辅助因子才能感染细胞，这种情况是不寻常的。也许，正是因为缺乏这种必要的辅助因子，科学家们才很难在实验室中培养人类诺如病毒。”（文章详见--Science：“魔剪”CRISPR又立一功，这次跟腹泻有关）
【2】Science：重磅！史上首次利用CRISPR-Cas9让人细胞变身为记忆存储系统
在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院（MIT）的研究人员设计出一种方法在人细胞的DNA中记录复杂的历史事件，从而允许他们通过对这种DNA进行测序从中找回过去事件的“记忆”。相关研究结果于2016年8月18日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Continuous genetic recording with self-targeting CRISPR-Cas in human cells”。
当前的这项研究中，由MIT开发出的这种新方法是基于基因组编辑系统CRISPR-Cas9实现的，其中这种系统是由一种DNA切割酶Cas9和一种引导这种酶结合到基因组特定位点上并指导它在这个位点进行切割的短链RNA---也被称作向导RNA（gRNA）---组成的。研究人员对这种CRISPR-Cas9系统进行改编以便在人基因组中储存信息。
利用CRISPR-Cas9对基因进行编辑时，研究人员构建出能够匹配宿主基因组中靶序列的gRNA。为了进行记忆编码，他们采取一种不同的方法：他们设计出识别编码这种gRNA的DNA序列的gRNA，从而产生他们称之为“自我靶向的gRNA（self-targeting guide RNA）。（文章详见--Science：重磅！史上首次利用CRISPR-Cas9让人细胞变身为记忆存储系统）
【3】Science“力挺”Nature：新型“魔剪”CRISPR，仅“改写”单个核苷酸！
近日，发表了在Science上的一项研究中，日本神户大学的科学家们开发了一种新型CRISPR系统，可对单个核苷酸进行修改，实现更精准的基因编辑。
利用脱氨酶，研究人员创建了一种修改版的CRISPR/Cas9。这种新版本的系统能够避免有害的双链切割，最小化CRISPR/Cas9技术引入的附带突变（collateral mutation），并且，不需要添加DNA模板。（文章详见--Science“力挺”Nature：新型“魔剪”CRISPR，仅“改写”单个核苷酸！）
【4】中国有望开展全球首个CRISPR基因编辑人体试验，治疗肺癌
Nature主页传来重磅消息。位于成都的四川大学华西医院有望率先进行全球首个将CRISPR-Cas9基因编辑技术应用到人体的试验。据华西医院的卢铀教授介绍，这项临床试验已在今年7月6日通过了长达半年的伦理审批，最早有望在下个月正式开展。这比宾州大学以及Editas公司预期在今年年底或明年年初进行的临床试验要来得更早。
根据Nature的报道，华西医院将招募那些患有非小细胞肺癌，癌症已经扩散，且化疗、放疗及其他治疗手段均已无效的患者。“对于这些患者来说，治疗手段相当有限，”卢铀教授说：“这项技术有望能给这些患者带来好处。”
按照计划，卢铀教授的团队会从招募的志愿者体内分离出T细胞，并利用CRISPR-Cas9技术对这些细胞进行基因编辑。他们将敲除这些细胞中的PD-1基因，并在体外进行细胞扩增。当细胞达到一定量后，卢铀教授计划将它们输回患者体内，并希望它们能够不被抑制，对肿瘤进行杀伤。（文章详情--重磅！中国有望开展全球首个CRISPR基因编辑人体试验，治疗肺癌）
【5】遗传大牛George Church新成果，用CRISPR/Cas识别SNPs
Cas9可以承受引导性RNA和靶序列之间的单个不匹配，但它可能无法承受更多。因此，该研究小组设计了一个引导性RNA筛查，使用引导性RNA——每个包含两个相对于野生型序列的突变，可切割赋予耐药性的一个特定突变，但它并非也切割野生型等位基因。一旦靶标突变成了不希望得到的序列，向导将仅通过一个单一不匹配而被关闭，从而使得Cas9切割和抑制不希望得到的副本。
该研究团队首先将该策略应用到β-内酰胺酶基因的一个特定突变，在高度致突变的背景中，这个基因编码氨苄青霉素的耐药性。含有一段对照引导性RNA的细胞，在氨苄青霉素上快速生长，而含有一个双突变体“调整向导RNA”（tgRNA）的细胞则没有。在这些细胞中，不需要的突变的出现，可诱导快速裂解，从而将该基因去除。
据Chavez说，这种方法——应该转化到更高级的生物中，在基因治疗、合成生物学和进化生物学以及其他领域，都有潜在的应用价值。例如，它可用来确保转基因细菌不会获得特异性的不理想性状，或用来研究有机体在常见逃生通路被切断时的应激反应。只需要一组候选引导性RNAs——在这种情况下是27个。（文章详情--遗传大牛George Church新成果，用CRISPR/Cas识别SNPs）
【6】利用CRISPR/Cas9系统治疗HBV感染取得突破性进展
在一项新的研究中，通过采用下一代测序（NGS）技术，来自美国福克斯蔡斯癌症中心（Fox Chase Cancer Cente）的 Christoph Seeger、Ji A Sohn和同事们确定了在Cas9切割和基于非同源末端连接（NHEJ）的修复后，HBV cccDNA所发生的完整突变谱。他们发现，90%以上的乙肝病毒DNA都能被Cas9切割。此外，研究结果还表明，在Cas9切割后对HBV DNA进行基因编辑的效率是在对被HBV感染的细胞进行α干扰素（IFN-α）处理后发生的APOBEC蛋白介导的胞嘧啶脱氨基作用的1500倍以上。研究还发现，以前用来检测DNA胞嘧啶脱氨基作用的3D-PCR方法方法高估了发生基因编辑的HBV DNA的数量和频率。
总之，研究人员证实CRISPR/Cas9系统是迄今为止在功能上让HBV cccDNA失活和提供一种慢性乙肝治愈疗法的最好途径。
另外，在一项新的研究中，来自中国同济大学生命科学与技术学院的研究人员利用CRISPR/Cas9系统靶向剔除HBV基因组中的保守性区域。通过让核酸内切酶Cas9携带HBV S基因和X基因的同源序列，他们构建出pCas9。通过利用pCas9开展实验，他们证实pCas9-2能够更好抵抗HBV产生，而且在Huh7和HepG2细胞之间没有显著差异。
【7】PLoS Pathog：利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多种疱疹病毒感染
大多数成年人携带着多种疱疹病毒。在初始的急性感染后，这些病毒在它们的宿主体内建立终生感染，并导致唇疱疹、角膜炎、生殖器疱疹、带状疱疹、传染性单核细胞增多症和其他疾病。一些疱疹病毒还能够导致人们患上癌症。在潜伏性感染阶段，这些病毒长时间地保持潜伏状态，但是保持偶尔重新激活的能力。这种重新激活有可能导致人们患病。一项新的研究提示着利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术攻击疱疹病毒DNA能够抑制病毒复制，而且在一些情形下，能够导致病毒清除。相关研究结果于2016年6月30日发表在PLoS Pathogens期刊上。
在这项新的研究中，来自荷兰乌德勒支大学医学中心的Robert Jan Lebbink和同事们认为应当能够靶向作用于被感染的人细胞中的潜伏性疱疹病毒DNA并让它们的DNA发生突变，因而潜在地阻止疱疹病毒相关的疾病。为了测试这一点，他们设计出特异性的向导RNA（gRNA），即与疱疹病毒基因组的关键部分互补的且发挥着分子地址作用的短RNA片段。这些gRNA当与CRISPR/Cas9系统中发挥着分子剪刀作用的Cas9结合在一起时，应当能够诱导在疱疹病毒DNA的特定位点上发生切割，随后诱导它们的DNA发生突变，从而破坏这些病毒。（文章详见--PLoS Pathog：利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多种疱疹病毒感染）
【8】Nature：利用CRISPR筛选出潜在的黄病毒药物靶标
在一项新的研究中，来自美国华盛顿大学医学院和宾夕法尼亚大学等机构的研究人员发现一种潜在的方法阻止寨卡病毒和类似的病毒在体内扩散的方法。相关研究结果于2016年6月17日在线发表在Nature期刊上。
研究人员鉴定出一种在寨卡病毒和其他黄病毒（flavivirus）在细胞间扩散中发挥着至关重要作用的基因通路。再者，他们证实关闭这个通路中的单个基因---在人细胞和昆虫细胞中---并不会对细胞本身产生负面影响，而且也使得黄病毒不能够从被感染的细胞中释放出来，从而阻止感染扩散。
这项研究给出寨卡病毒和其他黄病毒如登革热病毒和西尼罗河病毒的一个潜在的药物靶标，其中黄病毒对公共卫生带来重大影响。(文章详见--Nature：利用CRISPR筛选出潜在的黄病毒药物靶标）
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