Science“力挺”Nature：新型“魔剪”CRISPR，仅“改写”单个核苷酸！
2016-08-06 头条号 / 生物探索 头条号（今日头条旗下创作平台）
CRISPR系统是目前生命科学领域最热门的技术之一。全球科学家也在积极推进基于这一技术的临床试验，希望能够将其用于解决人类健康问题。然而，这一系统的转化应用仍需克服脱靶效应等技术限制。近日，发表了在Science上的一项研究中，日本神户大学的科学家们开发了一种新型CRISPR系统，可对单个核苷酸进行修改，实现更精准的基因编辑。 8月4日，发表在《科学》（Science）杂志上的这项研
CRISPR系统是目前生命科学领域最热门的技术之一。全球科学家也在积极推进基于这一技术的临床试验，希望能够将其用于解决人类健康问题。然而，这一系统的转化应用仍需克服脱靶效应等技术限制。近日，发表了在Science上的一项研究中，日本神户大学的科学家们开发了一种新型CRISPR系统，可对单个核苷酸进行修改，实现更精准的基因编辑。
8月4日，发表在《科学》（Science）杂志上的这项研究中，日本神户大学的Akihiko Kondo教授带领的科学家小组通过将一种被修饰过的Cas9酶与来源于七鳃鳗（sea lamprey）免疫系统中一种酶结合，找到了编辑单一DNA核苷酸的新方法。
简单来说，利用脱氨酶，研究人员创建了一种修改版的CRISPR/Cas9。这种新版本的系统能够避免有害的双链切割，最小化CRISPR/Cas9技术引入的附带突变（collateral mutation），并且，不需要添加DNA模板。
Akihiko Kondo 教授
（图片来源：http://www.csrs.riken.jp/en/labs/cfrt/index.html）
目标：创建更精准的基因编辑工具
借助传统的CRISPR/Cas9系统，研究人员是通过引入Cas9酶到细胞中编辑DNA序列，从而产生双链切割；同时，细胞会利用引入的DNA模板修复缺口。这一编辑过程是依赖细胞的同源重组机制，但包括非同源性末端接合（NHEJ）在内的其它机制会阻碍修复过程，常常导致不必要的、不精确的插入和删除。
为了创建一个更加精准的工具，Kondo和他的同事选择了两种修饰过的Cas9，分别与来自七鳃鳗的激活诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase ，AID）进行了融合。一种是核酸酶失活版Cas9（nuclease-dead Cas9），这种版本的Cas9不能够“切开”双链DNA；另一种是切口酶版Cas9（nickase Cas9），这种版本的Cas9能够产生一个缺口，即切割DNA单链。
AID的作用通常是会使免疫球蛋白和抗体基因产生突变，形成免疫系统的多样性。具体来说，AID只对单链DNA发挥作用，能够将胞嘧啶(C)替换为尿嘧啶(U)。
验证：两种新型复合物是否有效
Complex formation of dCas9-gRNA and PmCDA1 induces targeted mutation
两种系统都“很好”
研究人员在缺乏内生AID样系统（AID-like system）的芽殖酵母中验证了这两种新型复合物的基因编辑能力。结果发现，当蛋白质复合物借助向导RNA靶向CAN1基因时，CAN1的突变频率比“非靶向”的基因增加了1000倍。
通过全基因组测序，研究人员发现，这种方法带来的脱靶突变很少。该研究的第一作者Keiji Nishida说：“这种脱靶突变率是可以接受的，比自然的背景突变率（natural background mutation rate）高不到10倍”。
研究人员还证明，将两种不同的导向RNAs和Cas9-AID复合物一起表达，能够同时“编辑”两个基因。这一基因编辑复合物在哺乳动物细胞系中也能发挥很好的效果，导致相对较少的脱靶突变。
此外，在酵母中，与表达标准CRISPR/Cas9系统的细胞相比，表达这两种基因编辑复合物的细胞都生长的更好。这一结果表明，这种新的基因编辑工具毒性也更低。
谁更好？
科学们还发现，与“nuclease-dead Cas9-AID”复合物相比，“nickase Cas9-AID”复合物的基因编辑效率略高些。它是在发生核苷酸替换相反的DNA链上创建一个小“缺口”。
是否能更好？
为了进一步修饰，研究人员将Cas9-AID这一复合物与另外一种酶（尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂）联系起来。这种酶的“加入”增加了Cas9-AID复合物形成“C to T”替换，以及最小化无意缺失突变产生（在哺乳动物细胞系中）的效率。
回顾：Nature曾发表类似技术首项研究
事实上，这是关于编辑单个碱基的CRISPR系统的第二篇报道。
2016年4月20日，发表在Nature上的一项研究中，哈佛大学化学生物学教授David Liu带领的研究小组利用不同的脱氨酶（来自大鼠）率先发表了相似的技术。科学家们报告称，一种经改造的CRISPR基因编辑系统能够赋予研究者们有效改变给定基因中单个DNA碱基的能力。
近几年，CRISPR/Cas9基因编辑系统被全球科学家们广泛应用，然而尽管很容易用它改变基因的功能，但是修复点突变一直是个未解的难题。Liu说：“这些点突变非常重要。事实证明，大多数与遗传变异相关的疾病都是点突变。”
对于Science发表的这一成果，他表示：“当一个重要的发现被重复时，对一个领域是很大的鼓舞，也会帮助领域的继续发展。”
两种技术的对比
Science上发表的这一Cas9-AID复合物系统被命名为Target-AID复合物。它具有很高的特异性，能够对目标基因中3到5个碱基对窗口（window）内的胞嘧啶(C)进行修改。
Liu表示，他们对突变窗口（mutation window）如此窄非常惊讶。相比之下，他的团队报告的基因编辑系统能够作用的突变窗口介于3-6个核苷酸之间。
他说：“要想发挥最大的作用，这种碱基编辑窗口不能太宽，也不能太窄。因此，这两种方法可以给研究人员更多的选择。”
展望：如何“走向”临床？
哈佛大学的遗传学大牛George Church表示，这些脱氨酶解决了大部分先前已有的基因编辑方法（包括TALENSs、ZFN和Cas9）存在的最大问题，即真正所需的 “基因编辑”会与通过NHEJ机制产生的随机插入和删除存在竞争。此外，这种基于脱氨酶的系统还降低了双键切割带来的毒性。
开发这种工具临床应用的一个关键问题是，进一步检查突变脱靶效应。另一个需要考虑的问题是，如何特异性的靶向目标序列中的单个“C”，而不影响邻近的“C”。
Kondo表示，他的团队将开展进一步的工作，将Cas9与其它酶进行结合，创建一个全系列的DNA编辑工具包，实现4个核苷酸替换之间的任意组合。
备注：本文部分内容编译自The-scientist，原标题“CRISPR: NoCutting Required”。
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