速来,山东中医大附院惊人发现:苦参碱成新宠,一举抑制M2巨噬细胞极化,小鼠异位骨化问题迎刃而解!
2024-08-29 梅斯循证中医药 MedSci原创 发表于上海
论文探讨了苦参碱对M2型巨噬细胞通过极化抑制HO能力的影响。
创伤性异位骨化(HO)是一种表现为骨组织在非骨骼组织中的异常形成的病理现象,多见于严重创伤或手术之后,例如骨折愈合、截肢手术或关节置换手术等情形。该病理状态不仅会导致疼痛和肿胀,还会对患者的日常活动能力和生活质量造成显著影响。尽管HO的具体机制尚未完全明了,但普遍认为它与炎症反应的加剧以及骨组织形成的异常密切相关。
苦参碱,一种具备抗炎、抗肿瘤及抗病毒等多重药理作用的药物,被广泛应用于治疗炎症和关节疼痛。有研究揭示了苦参碱对巨噬细胞向M2表型极化的影响,其作用机制可能与抗炎活性紧密相关。具体而言,苦参碱可能通过干预特定信号通路,抑制巨噬细胞的M2极化。这一发现为苦参碱在抑制HO方面的应用提供了理论基础。
近日,一篇名为“Matrine reduces traumatic heterotopic ossification in mice by inhibiting M2 macrophage polarization through the MAPK pathway”的论文探讨了苦参碱对M2型巨噬细胞通过极化抑制HO能力的影响。
图1 论文首页
苦参碱抑制BMDM向M2巨噬细胞的极化
研究验证了巨噬细胞在小鼠体内HO形成中的作用,并利用CCK-8法来评估苦参碱对巨噬细胞增殖的影响。实验设置了10μM和20μM的浓度梯度。通过免疫荧光(IF)和流式细胞术,确认M2巨噬细胞诱导成功。首先,通过RT-PCR检测,研究发现在20ng/mL IL-4处理后,骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中M2巨噬细胞标志物IL-10、TGF-β1、CD206和ARG-1的表达水平显著高于对照组(图2A-D)。然而,当与10μM或20μM苦参碱共同处理后,这些基因的表达水平显著降低(p<0.01)。
接着,研究者使用流式细胞术检测CD206的表达。结果显示,IL-4刺激BMDMs后,CD206的表达显著高于对照组(p<0.001)。但经过20ng/mL苦参碱处理后,这些基因的表达显著降低(p<0.001)(图2E、F)。此外,通过IF实验检测CD206的表达,研究发现IL-4处理后,BMDM中CD206的荧光强度较对照组有所增加。然而,经过20ng/mL苦参碱处理后,荧光强度明显降低(图2G)。这些结果表明,苦参碱能够抑制BMDM向M2表型的极化。
图2 苦参碱抑制巨噬细胞向M2的极化
苦参碱抑制BMDMs中的MAPK信号通路
该研究利用蛋白印迹法验证了苦参碱对MAPK信号通路的作用。实验中,首先将苦参碱(20μM)作用于BMDMs或不作处理,持续3小时,随后加入IL-4进行刺激。通过蛋白印迹法,分析了p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-P38和P38的蛋白表达水平。结果显示,苦参碱能够抑制p-ERK和p-P38的磷酸化,并呈现出时间依赖性,而对p-JNK的磷酸化无明显影响(图3A)。利用ImageJ软件,研究对p-ERK、p-JNK和p-P38的相对表达量进行了定量分析,并将其分别标准化至总ERK、JNK和P38的水平(图3B-D)。这些数据共同揭示了苦参碱在BMDMs中对MAPK信号通路具有抑制作用。
图3 苦参碱抑制M2巨噬细胞中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路
苦参碱对MC3T3-E1细胞的成骨分化或矿化没有直接影响
在对MC3T3-E1细胞进行成骨诱导后,研究者采用不同浓度的苦参碱对细胞进行了处理。七天后,对细胞进行了碱性磷酸酶(ALP)活性染色,到第二十一天,进行了茜素红(AR)矿化染色(图4A)。定量分析结果显示:苦参碱对MC3T3-E1细胞的成骨分化或矿化过程并没有直接的影响(图4B、C)。
图4 苦参碱对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响
苦参碱抑制小鼠跟腱的异位骨形成
研究经八周建模后收集了小鼠的跟腱组织样本。初步的显微CT扫描揭示,在高骨化(HO)组小鼠的跟腱中,骨化组织的形成十分明显。然而,接受不同浓度苦参碱处理的小鼠,骨化现象显著减少(图5A)。统计分析显示,骨化组织的体积存在显著差异(p<0.001)(图5B)。接下来,研究利用免疫组化(IHC)技术检测了CD206和磷酸化ERK(p-ERK)的表达情况(图5C)。
在HO组小鼠中,CD206和p-ERK的表达水平显著上升。相比之下,在接受不同浓度苦参碱处理的小鼠中,这两种蛋白的表达水平显著下降(p<0.01)(图5D、E)。最后,研究通过IF技术检测了各组小鼠OCN的表达情况(图5F)。结果显示,HO组小鼠OCN的表达水平明显升高,而在不同浓度苦参碱处理的小鼠中,OCN的表达水平显著降低(p<0.001)(图5G)。综合以上结果,可以得出结论:苦参碱能够有效抑制小鼠的高骨化现象,并且能够降低CD206和p-ERK的表达水平。
图5 苦参碱可减弱小鼠体内HO的形成
结论
综上所述,该研究揭示了巨噬细胞与HO之间错综复杂的相互作用。苦参碱通过调节巨噬细胞的极化状态,并抑制MAPK信号通路的关键成分,展现出了作为治疗HO潜在候选药物的潜力。未来的研究应当着重于解析其精确的分子作用机制,评估最佳剂量方案,以及长期的安全性和临床疗效。
参考文献:
Wang H, Wang X, Zhang Q, Liang Y, Wu H. Matrine reduces traumatic heterotopic ossification in mice by inhibiting M2 macrophage polarization through the MAPK pathway. Biomed Pharmacother. 2024 Aug;177:117130. doi: 10.1016/j.biopha.2024.117130
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