病理干货 | 病理科建设PCR实验室：需要了解的问题有哪些？

01 什么是PCR？

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR技术具有灵敏度高、特异性好、及时方便等优点，是目前最为成熟、临床应用最广泛的分子诊断技术，广泛应用于感染性疾病病原体核酸检测、肿瘤基因检测、遗传病基因检测、化学药物用药指导的基于检测等多个领域。

02 PCR实验室有什么要求？

PCR实验室又称临床基因扩增检验实验室、分子实验室，是分子诊断的基础，也是进行PCR实验的必备场所。近年来，已逐渐成为临床辅助诊断领域必不可少的一部分，如何规划一个合格的实验室是每一个PCR从业者首先要遇到的问题。根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》要求，原则上临床基因扩增检验实验室应当设置以下区域（需要4间房）：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。

这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通，即各区要有独立的通风系统，并有缓冲间。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

1 试剂贮存和准备区：

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对气流压力的控制，本区并没有严格的要求。

2 标本制备区：

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

3 扩增区：

该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA（来自样本制备区）的加入和主反应混合液（来自试剂贮存和制备区）制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

4 扩增产物分析区：

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定分析。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。

当然，随着科技的发展，用于PCR检测的设备的功能及自动化均在不断的更新升级，根据使用仪器的功能，PCR实验室的功能区可适当合并。例如：使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；使用集样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。另外，没有什么是一成不变的，要因地制宜，具体问题要具体分析。

03 建设PCR实验室需要哪些设备？

临床基因扩增实验室应配置检测工作所需的设备，按实验室工作区域划分，仪器设备基本配置标准如下：

① 试剂储存和准备区：

应包括2~8℃和-20℃以下冰箱、混匀器、微量加样器（覆盖0.2~1000μl）、固定紫外灯和可移动紫外灯（近工作台面）、消耗品、专用工作服、工作鞋（套）和专用办公用品。

② 标本制备区：

应包括2~8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱、低温高速离心机、混匀器、水浴箱或加热模块、微量加样器、可移动紫外灯（近工作台面）、二级生物安全柜、紫外分光光度计、消耗品、专用工作服和工作鞋（套）和专用办公用品。

③ 扩增区：

应包括各种核酸扩增仪、微量加样器、可移动紫外灯（近工作台面）；消耗品、专用工作服和工作鞋和专用办公用品。

④ 产物分析区：

应包括与检测项目相一致的设备、微量加样器、电泳仪器设备、凝胶成像系统、可移动紫外灯（近工作台面）、消耗品、专用工作服、工作鞋和专用办公用品。

*注意，以上为实验室建设指南推荐的基本配置，其中部分检测分析设备可由自动化程度更高的检测设备代替，若实验有更高的生物安全要求，应酌情添加相关设备。

04 PCR实验室的建设可参考哪些条例？

《实验室生物安全通用要求》国家标准GB19489-2008

《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫医发[2002]8号文

《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[2002]10号文

《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》卫医发[2002]10号文附件

《基因检验实验室技术要求》国家质监检验总局SN/T1193-2003

《洁净室及相关受控环境-生物污染控制》国际标准ISO14698

《洁净厂房设计规范》国家标准GB500732013

《洁净室施工及验收规范》GB50591-2010

《室内空气质量标准》国家标准GB/T18832002

《生物安全实验室建筑技术规范》国家标准GB50346-2011《病原微生物实验室生物安全管理条例》卫生部(2004-11-12)

05 病理科建设PCR实验室可以开展哪些项目？

1 肿瘤相关基因检测：

EGFR基因突变、KRAS基因突变、NRAS基突变、BRAF基因突变、EML4-ALK基因融合、EML4-ROS1基因融合、PIK3CA基因突变、ROS1基因突变、UGT1A1基因检测等，可用于肿瘤分子分型、靶向用药伴随诊断、化疗药物疗效评估、肿瘤预后评估等。

2 肿瘤早期筛查：

肠癌基因甲基化检测、宫颈癌基因甲基化检测、肺癌基因甲基化检测、肝癌基因甲基化检测、膀胱癌基因甲基化检测等。

3 代谢疾病相关基因检测：

氯此格雷代谢相关基因检测（CYP2C19基因分型检测）、华法林代谢相关基因检测（CYP2C9和VKORC1基因多态性检测）、他汀类药物代谢相关基因检测（SLCO1B1和APOE基因多态性检测）、叶酸代谢能力基因检测（MTHFR基因分型检测）、高血压药物代谢相关基因检测（AGTR1、ACE、ADRB1、CYP2D6、CYP2C9基因多态性检测）等。

4 病原体核酸检测：

人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测、呼吸道病原体核酸检测、结核分枝杆菌核酸检测等。

06 医院应如何选择PCR检测项目？

项目并非应开尽开就好。项目开展后，若是不能达到一定的检测量，会大大增加科室的运营成本，所以应该根据医院的具体情况，结合患者类型和临床需求，选择合适医院发展的项目。

PCR检测项目需要考虑试剂与设备的兼容性。PCR检测设备种类繁多，即使都是同种技术方法，也并不是所有的设备都能兼容不同厂家生产的试剂，反之亦然。

开展的项目数还应该考虑PCR实验室的场地大小及从事PCR检验的技术员数量。从事PCR检验是技术员，必须要取得临床基因扩增检验技术人员上岗证并处于有效期。

根据标本量的情况合理安排开展项目的检测周期，同时应考虑到科室运营成本及报告时效。

07 PCR实验室正式运营前需要有哪些准备？

完成省临检中心对PCR实验室的验收工作，获取基因扩增实验室检验资质，在这之前不可以向临床患者收取检测费用。

完成项目开展院内启动会，通知临床科室可院内完成相关项目检测。

参考文献

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